【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医学领域，具体地说，是脱氧胞苷激酶dck s74位点磷酸化多克隆和单克隆抗体的设计与制备，以及通过免疫印迹或免疫组化检测，应用该抗体评估吉西他滨的抗肿瘤疗效。
技术介绍
1、吉西他滨(gemcitabine)是一种脱氧胞苷类似的化疗药物，广泛用于各种实体肿瘤的一线或超适应症治疗，包括胰腺导管腺癌、胆道系统肿瘤、乳腺癌、卵巢癌和非小细胞肺癌等(binenbaum et al.,2015)。尽管吉西他滨在临床上取得很大成功，但仍有超70％的晚期胆管癌患者和超90％的胰腺癌患者对吉西他滨的反应性不佳。如何预测以吉西他滨为基础的一线化疗方案的疗效，并为患者及时展开后续二线或靶向治疗，是目前晚期胆管癌和胰腺癌治疗的难点。开发可预测吉西他滨疗效的生物标志物，可避免因一线方案治疗无效而导致病情延误，提升晚期肿瘤的治疗水平。
2、吉西他滨发挥抗肿瘤作用经历三个步骤：第一步是摄取，吉西他滨首先需由细胞膜表面的人核苷转运体(human nucleoside transorters，hnts)进入细胞内；已有研究表明，吉西他滨主要经过hent1，其次通过hent2、hcnt1和hcnt3摄入细胞内(ritzel,m.w.,ng,a.m.,yao,s.y.,graham,k.,loewen,s.k.,smith,k.m.,hyde,r.j.,karpinski,e.,cass,c.e.,baldwin,s.a.,et al.(2001).recent molecular advances in studies of the
3、dck是哺乳动物细胞中脱氧核苷补救途径的限速酶，并在众多核苷类似的抗肿瘤和抗病毒药物，如吉西他滨、氟达拉滨、克拉屈滨、扎西他滨和拉夫米定的激活中起关键作用(de clercq,e.(2004).antiviral drugs in current clinical use.j clin virol30,115-133.galmarini,c.m.,mackey,j.r.,and dumontet,c.(2002).nucleosideanalogues and nucleobases in cancer treatment.lancet oncol 3,415-424.pettitt,a.r.(2003).mechanism of action of purine analogues in chronic lymphocyticleukaemia.br j haematol 121,692-702.)。然而，dck在肿瘤中极少发生突变、缺失或表达失调，单纯检测dck的蛋白表达水平来预测吉西他滨的疗效可能不尽如人意。值得注意的是，dck的催化活性受自身磷酸化修饰调控，包括t3、s11、s15和s74等位点；其中，s74是主要的磷酸化位点；该位点的磷酸化，将显著提升dck与吉西他滨等多种底物的亲和力，促进dck的催化活性和吉西他滨的药效；此外，dck s74位点可以响应包括吉西他滨在内的多种药物刺激，发生磷酸化修饰(smal,c.,vertommen,d.,bertrand,l.,ntamashimikiro,s.,rider,m.h.,van den neste,e.,and bontemps,f.(2006).identification of in vivophosphorylation sites on human deoxycytidine kinase.role of ser-74in thecontrol of enzyme activity.j biol chem 281,4887-4893.zhong,r.,xin,r.,chen,z.,liang,n.,liu,y.,ma,s.,and liu,x.(2016).the role of deoxycytidine kinase(dck)in radiation-induced cell death.int j mol sci 17.)；因此，开发特异性抗体，通过免疫印迹或免疫组化的方法检测dck s74位点的磷酸化水平，可以方便、有效地评估dck的催化活性，进而预测吉西他滨的疗效。目前，市面上还没有识别dck s74位点磷酸化的商品化抗体，也缺乏通过检测dck s74位点磷酸化来判断吉西他滨药效的试剂或试剂盒。此外，在肿瘤临床队列中，dck s74位点磷酸化与吉西他滨化疗效果之间的相关性尚未获得实验验证。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供新的特异识别dck s74位点磷酸化修饰的抗体，该系列抗体具有良好的免疫印迹和免疫组化检测能效；本专利技术还提供了一种新的预测吉西他滨抗肿瘤疗效的方法，即应用该特异性抗体通过免疫组化检测肿瘤组织中dck s74位点磷酸化水平，可以有效地预测吉西他滨的疗效。本专利技术提供的新的抗体和药效评估方法，可用于本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.检测肿瘤细胞和组织中DCK S74位点磷酸化水平的试剂在制备吉西他滨药效评估试剂和伴随诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测肿瘤细胞和组织中DCK S74位点磷酸化水平的试剂是识别DCK S74位点磷酸化修饰的特异性抗体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的特异性抗体是特异性识别DCK S74位点磷酸化修饰的多克隆抗体，单克隆抗体或纳米抗体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是通过免疫组织化学的方法检测肿瘤患者病理标本中DCK S74位点的磷酸化水平，并对染色结果评估，即免疫组化的染色评分；根据该评分将肿瘤患者分成DCK S74磷酸化高低表达组，DCK S74磷酸化高表达组的患者对吉西他滨治疗的反应性好，而低表达组的患者对吉西他滨治疗的反应性差。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为胆管癌、胰腺导管腺癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。
6.特异性识别DCK S74位点磷酸化修饰的多克隆抗体，其特征在于，所述的多克隆抗体的制
7.特异性识别DCK S74位点磷酸化修饰的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体的制备方法：通过合成肽段1：Cys+EELTMS(p)QKNGG和肽段2：TMS(p)QKNGGNVLQMMY+Cys，并偶联血蓝蛋白作为抗原，混合免疫小鼠，经血清效价及免疫印迹验证后，选择阳性小鼠的脾脏进行细胞融合；通过HAT培养基筛选得到阳性杂交瘤细胞，将阳性杂交瘤细胞通过有限稀释法亚克隆得到单克隆细胞株，每次亚克隆期间进行2-3轮间接ELISA筛选，得到符合要求的阳性单克隆细胞株，并纯化获得p-DCK S74单克隆抗体，克隆号52-D4-A2。
8.根据权利要求7所述的单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CCTCCNO:C2023306的杂交瘤细胞株分泌产生。
9.一种预测吉西他滨抗肿瘤疗效的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含识别DCKS74位点磷酸化修饰的特异性抗体。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒通过免疫组化检测肿瘤组织中DCK S74位点磷酸化水平，预测吉西他滨的疗效；DCK S74位点磷酸化高表达组的肿瘤患者对吉西他滨治疗的反应性更好，无疾病进展生存期和总生存期更长。
...【技术特征摘要】
1.检测肿瘤细胞和组织中dck s74位点磷酸化水平的试剂在制备吉西他滨药效评估试剂和伴随诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的检测肿瘤细胞和组织中dck s74位点磷酸化水平的试剂是识别dck s74位点磷酸化修饰的特异性抗体。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的特异性抗体是特异性识别dck s74位点磷酸化修饰的多克隆抗体，单克隆抗体或纳米抗体。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是通过免疫组织化学的方法检测肿瘤患者病理标本中dck s74位点的磷酸化水平，并对染色结果评估，即免疫组化的染色评分；根据该评分将肿瘤患者分成dck s74磷酸化高低表达组，dck s74磷酸化高表达组的患者对吉西他滨治疗的反应性好，而低表达组的患者对吉西他滨治疗的反应性差。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤为胆管癌、胰腺导管腺癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。
6.特异性识别dck s74位点磷酸化修饰的多克隆抗体，其特征在于，所述的多克隆抗体的制备方法：通过合成肽段1：cys+eeltms(p)qkngg和肽段2：tms(p)qknggnvlqmmy+cys，并偶联血蓝蛋白作为抗原，混合免疫新西兰兔；...
【专利技术属性】
技术研发人员：王红阳，蒋添翼，董立巍，崔笑雯，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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