【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物，具体地说，是使用微流控芯片检测4种蚊媒相关病原体表达的特异性探针和检测技术及其应用。
技术介绍
1、蚊媒传染病是由病媒蚊子传播的自然疫源性疾病，常见的有流行性乙型脑炎、登革热、黄热病等危害性较强的传染病。蚊媒传染病具有传播区域广、传播速度快、致病人数多等特点，对人类身体健康具有巨大的潜在威胁。蚊媒传染病在我国每年传染病总发病病例中约占5％-10％，但其病死数则占传染病总病死数的30％-40％。近年来，随着全球气候的变暖、城市化进程的加快、世界各国贸易往来的频繁以及国际间交通工具运输的快捷便利、生态环境的不断恶化，全球蚊媒传染病发病呈上升趋势，原有蚊媒传染病的流行区域不断扩展、疾病的流行频度不断增强，为媒介生物繁殖、传播、扩散提供了便利条件。在不同地区和国家间以及洲际间传播和流行，甚至上升为国际关注的突发公共卫生事件。我国蚊媒生物种类繁多，分布情况复杂，近年来也出现国外重大或新发蚊媒传染病病例的输入，导致我国蚊媒传染病防控风险增加。如何有效地应对传播迅速虫媒传播病毒和及早的发现患者，是目前生物安全急需解决的关键科学问题。
2、登革热是全球流行最广的虫媒病毒病之一，主要发生在全球热带和亚热带气候地带，多在城市和半城市地区，其发病率近几十年在全球大幅度上升，每年约有3.9亿人发生登革病毒感染，其中9600万人出现临床症状。登革热由登革病毒引起，主要传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊，临床特点为突起发热，全身肌肉、骨、关节痛，极度疲乏，皮疹，淋巴结肿大及白细胞减少。登革病毒属黄病毒科黄病毒属，呈球形，直径4
3、黄热病是一种由黄热病毒引起病毒性出血热，主要经蚊媒传播，以发热、出血、黄疸为主要临床表现，在非洲及美洲地区多见，对人类健康造成严重威胁。根据who估计每年有约20万人感染黄热病，3万人因此失去生命，其中90％发生在非洲。黄热病病毒是黄病毒科黄病毒属的一种单股正链rna病毒，病毒为球形颗粒，直径约40-60nm，外有脂质包膜包裹，表面有棘突，只有一个血清型，与登革热等其他黄病毒可产生交叉免疫。大部分黄热病毒染者临床表现较轻微，只有少部分感染者会出现急性期临床症状，主要包括寒战、发热、背痛、肌痛、恶心、呕吐和厌食等，通常在3-4天缓解。约有1/6的急性期感染者会进人中毒期，主要表现为呕吐、反复发热、黄疸、倦怠、大出血及肾功能衰竭等。绝大多数轻症感染者能康复，但出现肝肾功能不全等重症感染者的病死率可达20％-50％。人对黄热病毒普遍易感，潜伏期一般为3-6天，症状不易与疟疾、伤寒、登革热等疾病相鉴别。因此，快速准确的实验室检测技术对于早期诊断黄热病十分重要。
4、基孔肯雅热是一种由基孔肯雅病毒引起的病毒性疾病。该病的临床表现主要包括头痛、乏力、发热、恶心、呕吐、关节疼痛和肌肉痛等，很多症状与登革热相似，临床上常误诊为登革热。虽然大部分感染者会在2周后痊愈，但大约25％的基孔肯雅热患者关节痛会持续1年以上。该病潜伏期为2-12天，一般为3-7天。基孔肯雅病毒(chikv)属于披膜病毒科的甲病毒属，是一种主要由伊蚊传播的球形包膜单股正链rna病毒，基因组大小约为12kb，含4种非结构蛋白(nsp1、nsp2、nsp3和nsp4)和5种结构蛋白(c、e3、e2、6k和e1)。目前尚无针对chikv的疫苗和有效抗病毒药物。基孔肯雅热的传染源主要是基孔肯雅病毒感染者(包括人类、猴子，以及其他野生动物)，通过感染基孔肯雅病毒的蚊子叮咬进行传播。埃及伊蚊、白纹伊蚊等蚊种均可传播基孔肯雅病毒。由于我国目前很少有人感染chikv，人群对其的免疫力普遍低，增加了基孔肯雅热流行的风险，疫情一旦暴发，必将给我国带来严峻的公共卫生问题及巨大的经济损失，因此研发早期有效的检测诊断技术显得极其重要。
5、流行性乙型脑炎以蚊虫叮咬传播为主的一种急性病毒性人畜共患传染病，死亡率高达20％-30％，30％-50％的患者会遗留神经或精神后遗症。乙脑病毒于1934年在日本发现，本病主要分布在亚洲远东和东南亚地区，多见于夏秋季，人对乙脑病毒普遍易感，全球每年新发病例数约67900例，其中约50％发生在中国。感染后多数呈隐性感染，潜伏期10-15天。病例主要集中在10岁以下儿童中，2-6岁发病率最高。乙脑病毒属于黄病毒科黄病毒属，是一种含有包膜的正向单链rna病毒，在人类中具有神经侵袭性和神经毒性。预防乙脑最有效的办法是接种疫苗。该病起病急，进展快，早期症状不典型，一旦出现呼吸衰竭，治疗棘手且致死、致残率高，如能在流行性乙型脑炎初期尽早诊断、积极规范治疗，可在最大程度上降低致死、致残率，减轻患者家庭及社会的负担。
6、除了黄热病和乙脑可以通过疫苗预防外，其他蚊媒传染病目前都还没有疫苗可以预防；在治疗上，也大多没有特效药，主要是对症治疗。主要的检测技术有病毒分离培养、血清学检测和分子生物学检测等，但这些方法对实验技术、条件等要求高，所需时间长，灵敏度相对较低，限制了其临床应用推广。血清学检测主要有间接免疫荧光法、elisa法、免疫印迹法、血凝抑制试验等。蚀斑减少中和试验是检测黄热病毒的金标准，能直接检测到病毒活力，但对实验室要求较高，并且检测过程较长。上述方法有的观察结果须特殊培训，有的需要特殊的设备，有的与其他病毒(如登革病毒、西尼罗病毒等)存在交叉反应，有假阳性，致使较难分析结果。与传统的病毒分离法相比，分子生物学检测方法的敏感性更高，更快速。随着分子生物学技术的飞速发展，rt-pcr技术、实时荧光定量pcr技术和lamp技术等都可用于病毒的检测，但是上述分子生物学方法需要在实验室完成，限制了其在现场快速检测中的应用；且上述方法均存在检测通量不足，检测范围有限的问题。虽然二代测序敏感度优势明显，可以同时检测多个样本，但价格昂贵，而且测序过程中产生的大量数据需要专业生物信息人员进行分析，不适用于实验室常规检测。
7、微流控芯片(microfluidic chip)是当前微全分析系统发展的热点领域，具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点，可直接将dna引物探针固定于芯片表面，样本通过与芯片上已知碱基序列的dna片段互补杂交，从而得到样品的遗传信息，确定样品的核酸序列，并可分析基因表达量。微流控芯片平行面的液体通道互相不影响，大大缩短检测时间，提升检测效率。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种检测的技术方法，微流控芯片检测，具有快速、准确、高灵敏度的特点，可为登革病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒和乙型脑炎病毒的快速检测和传染病防控提供一种新的技术手段。
2、本专利技术结合蚊媒相关登革病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒和乙型脑炎病毒检测的实际需求，研发了微流控芯片，该方法敏感性强，特异度高，所用试剂耗材均可常温保存，便于运输携带本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于微流控技术的蚊媒相关病原体检测方法，其特征在于，所述的蚊媒相关病原体为登革病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒和乙型脑炎病毒；所述的检测方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于微流控技术的蚊媒相关病原体检测方法，其特征在于，所述的样本检测孔和阴性对照孔中预封装的检测试剂如表2所示，所述的阳性对照孔中预封装的检测试剂如表3所示：
3.根据权利要求1所述的基于微流控技术的蚊媒相关病原体检测方法，其特征在于，步骤(C)中所述的反应条件如表4所示：
【技术特征摘要】
1.一种基于微流控技术的蚊媒相关病原体检测方法，其特征在于，所述的蚊媒相关病原体为登革病毒、基孔肯雅病毒、黄热病毒和乙型脑炎病毒；所述的检测方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于微流控技术的蚊媒相关病原体检测方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：殷建华，曹广文，蒲蕊，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军军医大学，
类型：发明
国别省市：
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