【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种基因工程菌株及使用此基因工程菌株产l-色氨酸的方法。
技术介绍
1、l色氨酸属于八种必需氨基酸之一，因其营养价值，已被广泛用于饲料、食品和药品等领域。l-色氨酸的生产方法包括化学合成法、酶反应法、发酵法等，但随着基因工程手段的逐渐完善，利用微生物直接发酵法来生产l-色氨酸得到迅速发展，该方法以葡萄糖等低价原料为碳源经微生物发酵生产得到目的产物，生产成本较低，生产工艺相对简单可控。
2、色氨酸生产菌种以葡萄糖为碳源时存在葡萄糖阻遏效应，即一旦菌种摄入过多葡萄糖则容易衰老死亡，因此生产上一般以流加的方式给菌种提供葡萄糖，避免菌体摄入过多葡萄糖而导致发酵异常。
3、在色氨酸生产过程中，如果由于操作失误或其他原因导致流加葡萄糖过多，则容易导致生产菌株代谢异常，发酵液变黑，经检测证实发酵液变黑是由于乙酸含量积累较多，一般情况下乙酸含量低于5g/l，菌体代谢不会异常，当乙酸含量超过5g/l则极容易发生代谢异常。一旦发生代谢异常，菌种的生物量和产酸会受到极大影响，给生产造成严重损失。因此，获得对葡萄糖耐受性高的生产菌体是十分迫切的。
技术实现思路
1、本专利技术公开了一种具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌株及使用此基因工程菌株产l-色氨酸的方法。解决了目前流加葡萄糖过多，容易导致生产菌株代谢异常，产酸受到影响的问题。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、一种具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌株，所述基因工程菌株是敲除
4、进一步的，所述原始菌株为大肠杆菌。
5、进一步的，所述seq id no:1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq id no:2所示。
6、进一步的，所述具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌株的构建方法包括如下步骤：
7、步骤1：根据菌株序列信息，设计引物upycjo-f，如seq id no.3所示、upycjo-r，如seq id no.4所示、doycjo-f，如seq id no.5所示和doycjo-r，如seq id no.6所示；
8、步骤2：使用所述引物从菌株基因组中扩增ycjo基因两侧同源臂基因序列，获得两段扩增片段；
9、步骤3：将两段扩增片段通过融合pcr技术融合得到重组片段td1，如seq id no:7所示；
10、步骤4：根据载体ptarget序列信息，设计引物ycjosgrna-f，如seq id no.8所示和ycjosgrna-r，如seq id no.9所示，使用引用ycjosgrna-f、ycjosgrna-r，以载体ptarget为模版进行pcr扩增，获得线性化的含有sgrna的ptyc；
11、步骤5：将线性化的含有sgrna的ptyc与重组片段td1连接构建重组质粒ptyc；
12、步骤6：将含有cas9蛋白的pcas9质粒转化入菌株，筛选出转化重组菌株；
13、步骤7：将重组质粒ptyc转化入步骤6筛选出的转化重组菌株，经筛选获得具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌株。
14、所述的具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌株在产l-色氨酸中的应用。
15、一种使用具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌株产l-色氨酸的方法，所述方法包括如下步骤：
16、步骤1：配制种子罐培养基、发酵培养基以及微量元素混合液；
17、步骤2：制备ycjo基因缺失菌株种子液；
18、步骤3：将种子罐培养基进行灭菌并冷却，调节ph为中性，将ycjo基因缺失菌株种子液接种至种子培养基中，培养至对数生长中后期；
19、步骤4：将发酵罐培养基进行灭菌并冷却，调节ph为中性，将对数生长中后期菌种接入发酵培养基中进行发酵培养以制取l-色氨酸发酵液。
20、进一步的，所述步骤3中将种子罐培养基冷却至36℃。
21、进一步的，所述步骤3中培养条件为温度36℃、ph值中性、溶氧25％-30％、罐压0.02mpa。
22、进一步的，所述步骤4中将发酵罐培养基冷却至36℃。
23、进一步的，所述步骤4中培养条件为温度36℃、ph值中性、溶氧25％-30％、罐压0.02mpa。
24、本专利技术公开了一种具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌株及使用此基因工程菌株产l-色氨酸的方法，所述基因工程菌株由于ycjo基因的失活而提高菌株对葡萄糖的利用效率，增加l-色氨酸的产量，提高糖酸转化率；所述基因工程菌株对葡萄糖的耐受性增加，降低补料工艺的严格程度。所述基因工程菌株可应用于大规模生产l-色氨酸，发酵指标具有显著优势，不易发生代谢异常和代谢溢流，大大降低生产成本，提高生产收益。
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1.一种具有L-色氨酸生产能力的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是敲除原始菌株内SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列获得。
2.根据权利要求1所述的具有L-色氨酸生产能力的基因工程菌株，其特征在于，所述原始菌株为大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的具有L-色氨酸生产能力的基因工程菌株，其特征在于，所述SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1所述的具有L-色氨酸生产能力的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的构建方法包括如下步骤：
5.权利要求1-4所述的具有L-色氨酸生产能力的基因工程菌株在产L-色氨酸中的应用。
6.一种使用具有L-色氨酸生产能力的基因工程菌株产L-色氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中将种子罐培养基冷却至36℃。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤3中培养条件为温度36℃、pH值中性、溶氧25％-30％、罐压0.02
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤4中将发酵罐培养基冷却至36℃。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤4中培养条件为温度36℃、pH值中性、溶氧25％-30％、罐压0.02MPa。
...【技术特征摘要】
1.一种具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株是敲除原始菌株内seq id no:1所示的核苷酸序列获得。
2.根据权利要求1所述的具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌株，其特征在于，所述原始菌株为大肠杆菌。
3.根据权利要求1所述的具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌株，其特征在于，所述seq id no:1所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列如seq id no:2所示。
4.根据权利要求1所述的具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株的构建方法包括如下步骤：
5.权利要求1-4所述的具有l-色氨酸生产能力的基因工程菌...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢煜，曹国强，周国旺，郭昊，张宇擎，李雪姚，杨娜，
申请(专利权)人：哈尔滨象柏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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