【技术实现步骤摘要】
(一)本专利技术涉及一种溶剂耐受型转氨酶突变体、基因工程菌及在制备西他列汀中间体中的应用。
技术介绍
0、(二)
技术介绍
1、西他列汀(sitagliptin)的商品名为捷诺维(januvia)，是由美国merck公司和codexis公司研制和开发，是fda批准用于治疗ⅱ型糖尿病的药物(2016年10月)。二肽基肽酶(dpp-4)是一个以同型二聚体形式存在于细胞膜上的多功能酶，它可以裂解包括促胰岛素释放肽(gip)和胰高血糖素样肽-1(glp-1)在内的多种肽类激素，而glp-1和gip能通过细胞内信号途径增加胰岛素合成及从胰岛β细胞的释放，抑制胰高血糖素的分泌及提高葡萄糖耐受水平。若dpp-4快速代谢glp-1和gip则会造成其促胰岛素作用丧失，血糖升高，进而引发糖尿病的形成。西他列汀通过抑制肠降血糖素经dpp-4的降解以增强glp-1和gip的功能，进而增加胰岛素释放并降低循环中胰高血糖素水平(此作用呈葡萄糖依赖性)，能够血糖依赖性地增加胰岛素的分泌，降糖作用较为适中，不会引发低血糖的发生，并且无增加体重、恶心、呕吐等副作用。dpp-4抑制剂可抑制gip、垂体腺苷酸环化酶激活多肽和胃泌素释放肽等参与调节血糖的其他肽类的降解。
2、西他列汀及其中间体的合成既有完全化学法合成，也有化学法与酶法相结合的。对于化学-酶法而言关键就是要获得一种超稳定ω-转氨酶，其能够催化西他列汀中间体前体酮不对称转氨反应获得光学纯西他列汀中间体。
3、美国专利us8293507公开了coexis公司对节杆菌来源的转
4、国际专利wo201009950公开了codexis公司开发的工程化转氨酶(野生型来源于arthrobacter sp.)，对溶剂dmso有很好的耐受性，但对醇类溶剂的耐受性不好；在酶催化反应中使用dmso，由于dmso沸点高，难以从反应体系中去除，使得反应产物在提纯过程中损失较大，导致成本较高。
5、国际专利w02007050485公开了默克公司关于西他列汀中间体的合成方法，采用了手性锗催化剂对烯胺的不对称氢化来合成手性胺，产率达到84％，ee值94％，但该方法需要用昂贵的锗手性催化剂，去除与回收也较为困难。
6、国际专利w02005003135公开了以s-苯甘氨酰胺来诱导催化氢化而合成手性胺的合成方法(默克公司)。该路线需要两次催化氢化，第一次所用的铂催化剂价格昂贵，第二次脱保护时需要用大量的pd(oh)2-c催化剂，成本较高，ee值为96％，需要进一步重结晶。
7、国际专利w02004087650公开了默克公司关于西他列汀中间体的合成路线，利用手性钌催化剂对酮进行不对称氢化构建手性醇，然后将手性醇转化成手性胺。该合成方法中，需要用到钌催化的不对称氢化，催化剂价格昂贵，总收率只有52％，工艺中用到高压氢气，立体选择性也不高。
8、美国专利us6699871公开了一种西他列汀中间体的化学合成方法，采用手性源来诱导出手性的alpha-氨基酸，而后通过重氮化反应产生beta-氨基酸来构建所需的手性中心。该路线所需的原料成本相对较高，反应较为麻烦，且产业化过程中工艺过程和产品质量都难以控制。
9、中国专利cn107384887公开了一种源于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(burkholderiagladioli)zjb-12126的ω-转氨酶，并对其进行了工程化改造。然而，cn107384887中公开的工程化转氨酶活性不够高，需要用到50g/l的湿菌体才能达到较高的转化率，且反应体系中dmso作为助溶剂的体积终浓度为10～40％，无法实现在高体积浓度dmso体系中体现较好的酶活性，无法实现较高的转化率。
10、中国专利cn108866021a公开了一种来源于节杆菌(arthrobacternitroguajacolicus)zjutb06-99的ω-转氨酶，经过改造后的ω-转氨酶在一定程度上解决了生产西他列汀中间体工艺中存在的立体选择性不佳、催化剂价格昂贵、溶剂难以回收等问题，但是仍然采用二甲基亚砜作为助溶剂，且优选二甲基亚砜体积终浓度为20％，然而工业化生产需要较高的底物浓度，对二甲基亚砜不耐受的酶蛋白将在工业化生产中难以发挥较好的作用。
11、中国专利cn102838511a公开了浙江海翔药业关于西他列汀中间体的生产方法，采用格氏试剂对手性环氧氯丙烷进行亲核取代，而后用氰化物进行取代水解合成beta-羟基酸，该方法总收率仅40％，而且采用剧毒氰化物，应用受限。
12、中国专利cn105018440a中，南京博优康远生物医药科技有限公司对分支杆菌(mycobacterium vanbaalenii)pyr-1来源的转氨酶进行改造得到的工程化转氨酶催化获得(r)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯。尽管该工程化转氨酶对乙醇等醇类溶剂有很好的耐受性，但催化活性不高，且转氨反应的产物需要经boc保护后才能进一步转化为boc保护的西他列汀，脱保护后得到西他列汀，导致成本较高，并且该氨基转移酶不能直接催化西他列汀前体酮得到西他列汀。
13、近年来，由于化学-酶法具有高选择性及环境优化的优势，逐步成为合成手性医药化学品及其中间体的首选方案。ω-转氨酶是生产西他列汀的关键酶。许多ω-转氨酶基因已被克隆，其中部分转氨酶的基因已在不同的宿主(大肠杆菌、毕赤酵母等)中表达，获得了酶活和选择性都较高的基因工程菌。尽管如此，对于r-型选择性转氨的天然ω-转氨酶报道很少，且这些ω-转氨酶催化的底物谱较窄，往往是为特定反应筛选的最适生物催化剂，因此大大限制了其应用范围。
14、现有技术报道的不对称合成西他列汀及其中间体存在总收率不高(一般低于50％)，立体选择性偏低(产物e.e.值普遍低于90％)、有机溶剂耐受性不高、热稳定性不高、金属催化剂昂贵、生物催化剂不能直接以西他列汀前体酮为底物等问题。
15、随着定向进化技术的发展，蛋白质工程越来越多地被用于改造酶的底物特异性，筛选具有较宽底物谱的新型转氨酶，研究其可以高效高选择性催化的手性药物及其中间体，不仅可以拓宽其应用范围，提升其应用潜力，也为实现工业化生产奠定基础。
技术实现思路
0、(三)
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种溶剂耐受型ω-转氨酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备西他列汀中间体中的应用，所述ω-转氨酶突变体直接以西他列汀中间体前体酮为底物、催化活性更高、热稳定性及有机溶剂(特别是dmso)耐受性更好，解决了现有合成西他列汀或其手性氨基中间体的工程化转氨酶技术中存在的立体选择性不佳、催化剂价格昂贵等问题。
2、本专利技术采用的技术方案是：
3、本专利技术提供一种溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种溶剂耐受型ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第60位、第92位、第186位进行单位点或多点联合突变获得。
2.如权利要求1所述ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸；(2)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸、第92位的丙氨酸突变成脯氨酸；(3)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸、第92位的丙氨酸突变成脯氨酸、同时第186位的亮氨酸突变成苯丙氨酸。
3.一种含权利要求1所述ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌。
4.一种权利要求1所述ω-转氨酶突变体在微生物催化西他列汀中间体前体酮制备西他列汀中间体中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以西他列汀中间体前体酮为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以pH 8～9三乙醇胺缓冲液为
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，湿菌体用量为10～50g/L，纯酶液用量以蛋白含量计为200-300g/L，底物终浓度为1～50g/L，二甲基亚砜体积终浓度为10～50％，磷酸吡哆醛0.25～2g/L，异丙胺20～50g/L。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述湿菌体按如下方法制备：将含ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种至含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃，200rpm下培养12h，再以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150rpm下培养至菌体OD600达0.6～0.8，加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃下诱导培养12h后，4℃、5000rpm离心20min，弃去上清液，收集沉淀，即获得所述的湿菌体；
8.一种权利要求1所述ω-转氨酶突变体在微生物催化潜手性羰基化合物制备西他列汀中间体中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以潜手性羰基化合物为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以pH 8～9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成催化体系，在40-50℃、500-1500rpm条件下进行生物催化反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得西他列汀中间体；所述潜手性羰基化合物包括3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸异丁酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述催化体系中，湿菌体用量为10～50g/,，纯酶液用量以蛋白含量计为200-300g/L，底物终浓度为1～50g/L，二甲基亚砜体积终浓度为10～50％，磷酸吡哆醛0.25～2g/L，异丙胺20～50g/L。
...【技术特征摘要】
1.一种溶剂耐受型ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体是将seq idno.2所示氨基酸序列第60位、第92位、第186位进行单位点或多点联合突变获得。
2.如权利要求1所述ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体是将seq idno.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸；(2)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸、第92位的丙氨酸突变成脯氨酸；(3)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸、第92位的丙氨酸突变成脯氨酸、同时第186位的亮氨酸突变成苯丙氨酸。
3.一种含权利要求1所述ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌。
4.一种权利要求1所述ω-转氨酶突变体在微生物催化西他列汀中间体前体酮制备西他列汀中间体中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以西他列汀中间体前体酮为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以ph 8～9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在40-50℃、500-1500rpm条件下进行生物催化反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得(r)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮；所述西他列汀中间体前体酮是指1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，湿菌体用量为10～50g/l，纯酶液用量以蛋白含量计为200-300g/l，底物终浓度为1～50g/l，二甲基亚砜体积终浓度为10～50％，磷酸吡哆醛0.25～2g/l，异丙胺20～50g/l。
7.如权利要求5所述的应用，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：程峰，沈晓愉，柳志强，张晓健，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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