一种溶剂耐受型转氨酶突变体、工程菌及在制备西他列汀中间体中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种溶剂耐受型转氨酶突变体、工程菌及在制备西他列汀中间体中的应用，所述ω‑转氨酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第60位、第92位、第186位进行单位点或多点联合突变获得。本发明专利技术转氨酶突变体以西他列汀中间体前体酮为底物，异丙胺为氨基供体，磷酸吡多醛为辅酶，二甲基亚砜为助溶剂，生物催化制备高光学纯度的西他列汀中间体，不仅有机溶剂耐受性高(在二甲基亚砜体积终浓度为50％反应体系下半衰期达28.4h)，且产物立体选择性高(产物e.e.值达到99％)，具有较好工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】

(一)本专利技术涉及一种溶剂耐受型转氨酶突变体、基因工程菌及在制备西他列汀中间体中的应用。

技术介绍

0、(二)
技术介绍

1、西他列汀(sitagliptin)的商品名为捷诺维(januvia)，是由美国merck公司和codexis公司研制和开发，是fda批准用于治疗ⅱ型糖尿病的药物(2016年10月)。二肽基肽酶(dpp-4)是一个以同型二聚体形式存在于细胞膜上的多功能酶，它可以裂解包括促胰岛素释放肽(gip)和胰高血糖素样肽-1(glp-1)在内的多种肽类激素，而glp-1和gip能通过细胞内信号途径增加胰岛素合成及从胰岛β细胞的释放，抑制胰高血糖素的分泌及提高葡萄糖耐受水平。若dpp-4快速代谢glp-1和gip则会造成其促胰岛素作用丧失，血糖升高，进而引发糖尿病的形成。西他列汀通过抑制肠降血糖素经dpp-4的降解以增强glp-1和gip的功能，进而增加胰岛素释放并降低循环中胰高血糖素水平(此作用呈葡萄糖依赖性)，能够血糖依赖性地增加胰岛素的分泌，降糖作用较为适中，不会引发低血糖的发生，并且无增加体重、恶心、呕吐等副作用。dpp-4抑制本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种溶剂耐受型ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第60位、第92位、第186位进行单位点或多点联合突变获得。

2.如权利要求1所述ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体是将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸；(2)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸、第92位的丙氨酸突变成脯氨酸；(3)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸、第92位的丙氨酸突变成脯氨酸、同时第186位的亮氨酸突变成苯丙氨酸。

3.一种含权利要求1所述ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌。...

【技术特征摘要】

1.一种溶剂耐受型ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体是将seq idno.2所示氨基酸序列第60位、第92位、第186位进行单位点或多点联合突变获得。

2.如权利要求1所述ω-转氨酶突变体，其特征在于，所述ω-转氨酶突变体是将seq idno.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸；(2)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸、第92位的丙氨酸突变成脯氨酸；(3)第60位的甘氨酸突变成丝氨酸、第92位的丙氨酸突变成脯氨酸、同时第186位的亮氨酸突变成苯丙氨酸。

3.一种含权利要求1所述ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述ω-转氨酶突变体在微生物催化西他列汀中间体前体酮制备西他列汀中间体中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用为：以含ω-转氨酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的纯酶液为催化剂，以西他列汀中间体前体酮为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以ph 8～9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在40-50℃、500-1500rpm条件下进行生物催化反应，反应结束后，反应液分离纯化，获得(r)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮；所述西他列汀中间体前体酮是指1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，湿菌体用量为10～50g/l，纯酶液用量以蛋白含量计为200-300g/l，底物终浓度为1～50g/l，二甲基亚砜体积终浓度为10～50％，磷酸吡哆醛0.25～2g/l，异丙胺20～50g/l。

7.如权利要求5所述的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：程峰，沈晓愉，柳志强，张晓健，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：