【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种细胞系gm27171在作为人类mthfr基因多态性检测用标准品中的应用。
技术介绍
1、叶酸又名蝶酰谷氨酸，对细胞生长以及蛋白质、氨基酸的合成起着关键作用，在人体内发挥着重要的生物学作用，缺乏叶酸可致多种疾病，如先天性心脏病、妊娠高血压、唐氏综合征等。
2、叶酸代谢途中有多种酶参与代谢与转运，5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)是甲硫氨酸-叶酸代谢系统中的关键酶，作用是催化同型半胱氨酸代谢的甲基供体5-甲基四氢叶酸合成；甲硫氨酸合成酶还原酶(mtrr)作用是将失活的甲硫氨酸合成酶还原为活性状态，维持甲基传递通路继续进行，降低同型半胱氨酸在体内的积累。mthfr与mtrr协同工作，维持叶酸的正常代谢，控制同型半胱氨酸在体内的正常水平。mthfr基因a1298c、c677t和mtrr基因a66g位点的突变，可导致酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，是造成叶酸代谢水平降低和同型半胱氨酸水平升高的遗传学原因。
3、基因多态性检测的主要方法有：限制性片段长度多态性(rflp)检测、生物质谱检测、测序法检测、taqman探针检测、基因芯片检测等方法。而这些方法在其特异性和灵敏度方面有很大差异。目前实时荧光定量pcr检测法相比普通pcr具有更高的灵敏度和特异性，被广泛应用。本项目标准品可贯穿基于荧光定量pcr基因检测的整个过程，建立从核酸提取到pcr扩增等流程的质量控制。对实验室内检测结果的失控状况及失控原因、了解不同医疗单位之间检验结果的差距具有十分重要的意义。
技术实
1、本专利技术的目的是提供细胞系gm27171在作为人类mthfr基因多态性检测用标准品中的应用。
2、本专利技术还公开了一种人类mthfr基因多态性检测用标准品，包括细胞系、细胞保护液，其特征在于所述细胞系为细胞系gm27171。
3、优选的，所述细胞保护液包括hepes，nahco3，d-葡萄糖和酚红，hepes的浓度为10-25mm，nahco3的浓度为15.-2.2g/l，d-葡萄糖的浓度为1-4g/l，酚红的质量浓度为0.5％。
4、优选的，还包括培养基，所述培养基为rpmi-1640培养基。
5、优选的，还包括胎牛血清，所述胎牛血清为fbs胎牛血清。
6、本专利技术还公开了前述的人类mthfr基因多态性检测用标准品的验证方法，其步骤包括：
7、(1)在培养基中加入谷氨酰胺和胎牛血清，预混，加入细胞系gm27171，对细胞系进行培养；
8、(2)提取含有mthfr基因c677t位点杂合突变型的细胞系gm27171基因组dna作为模板，通过sanger测序对多态性位点进行验证；
9、(3)对提取的mthfr基因c677t位点杂合突变型细胞系gm27171基因组dna进行绝对定量测定；
10、(4)采用荧光定量pcr法，以提取的gm27171细胞系的基因组dna为模板，进行基因分型验证，标准品均匀性验证。
11、根据权利要求6所述的验证方法，其特征在于步骤(4)中的引物序列为：
12、上游引物667f：aaggccaccccgaagcag，
13、下游引物667r：ccttcacaaagcggaagaatg，
14、内参上游引物rnp-for：agatttggacctgcgagcg，
15、内参下游引物rnp-rev：gagcggctgtctccacaagt，
16、fam探针h675p+1：5’fam-agccgatttcatcatc-3’mgb，
17、hex探针h677p-1：5’hex–agtcgatttcatcatc-3’mgb。
18、优选的，其中内参采用rnp基因。
19、优选的，步骤(3)中采用数字pcr法进行定量。
20、本专利技术提供了一种人类mthfr基因多态性检测标准品，细胞系质控品接近于临床样本，更好的模拟临床检测，优于现有方法标准品，重组质粒由于不同实验室间存在序列选取差异，不能适用于市场上所有试剂盒，且无法准确对市场上所有个体化用药基因检测试剂盒进行鉴别。
21、采用数字pcr法和荧光pcr法双重定量，精密度好。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.细胞系GM27171在作为人类MTHFR基因多态性检测用标准品中的应用。
2.一种人类MTHFR基因多态性检测用标准品，包括细胞系、细胞保护液，其特征在于所述细胞系为细胞系GM27171。
3.根据权利要求2所述的人类MTHFR基因多态性检测用标准品，其特征在于所述细胞保护液包括HEPES，NAHCO3，D-葡萄糖和酚红，其中HEPES的浓度为10-25mM，NAHCO3的浓度为15.-2.2g/L，D-葡萄糖的浓度为1-4g/L，酚红的质量浓度为0.5％。
4.根据权利要求2所述的人类MTHFR基因多态性检测用标准品，其特征在于还包括培养基，所述培养基为RPMI-1640培养基。
5.根据权利要求4所述的人类MTHFR基因多态性检测用标准品，其特征在于还包括胎牛血清，所述胎牛血清为FBS胎牛血清。
6.权利要求2-5中任一项所述的人类MTHFR基因多态性检测用标准品的验证方法，其特征在于其步骤包括：
7.根据权利要求6所述的验证方法，其特征在于步骤(4)中的引物序列为：
8.根据权利要求7所
9.根据权利要求6所述的验证方法，其特征在于步骤(3)中采用数字PCR法进行定量。
...【技术特征摘要】
1.细胞系gm27171在作为人类mthfr基因多态性检测用标准品中的应用。
2.一种人类mthfr基因多态性检测用标准品，包括细胞系、细胞保护液，其特征在于所述细胞系为细胞系gm27171。
3.根据权利要求2所述的人类mthfr基因多态性检测用标准品，其特征在于所述细胞保护液包括hepes，nahco3，d-葡萄糖和酚红，其中hepes的浓度为10-25mm，nahco3的浓度为15.-2.2g/l，d-葡萄糖的浓度为1-4g/l，酚红的质量浓度为0.5％。
4.根据权利要求2所述的人类mthfr基因多态性检测用标准品，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：张陆明，马晓璐，
申请(专利权)人：江苏普若维生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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