【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，特别涉及一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法。
技术介绍
1、解聚素金属基质蛋白酶10是一种锌离子依赖的蛋白酶，能够切割notch、多种cadherin、cd44等多种蛋白胞外区与跨膜区临近处的egf样结构域，从而介导跨膜蛋白的胞外区脱落，调控细胞的解聚、迁移以及多种信号的转导。
2、adam10在免疫系统发育、免疫细胞迁移以及炎症信号调控中均发挥重要作用，在肿瘤发病和进展中也有一定作用，靶向adam10的治疗有望为多种炎症及免疫相关疾病乃至肿瘤提供新的治疗手段。但是，adam10缺少良好的小分子抑制剂，现有的adam10抑制剂gi254023x抑制纯的adam10活性高度有效，但在细胞上表现不佳，在动物在体水平对adam10的作用令人失望。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，所述优化方法是通过同义突变替换掉adam10pro-domain天然序列中的稀有密码子，且通过同义突变平衡编码序列的gc含量；
3、所述adam10 pro-domain编码序列的优化位点包括精氨酸atg→cgc/cgt、谷氨酰胺caa→cag、天冬酰胺aat→aac、酪氨酸tat→tac、亮氨酸tta→ctg、亮
4、需要说明的是，adam10的pro-domain(对应人adam10 cds区)序列如下：
5、ggtcagtatgggaatcctttaaataaatatatcagacattatgaaggattatcttacaatgtggattcattacaccaaaaacaccagcgtgccaaaagagcagtctcacatgaagaccaatttttacgtctagatttccatgcccatggaagacatttcaacctacgaatgaagagggacacttcccttttcagtgatgaatttaaagtagaaacatcaaataaagtacttgattatgatacctctcatatttacactggacatatttatggtgaagaaggaagttttagccatgggtctgttattgatggaagatttgaaggattcatccagactcgtggtggcacattttatgttgagccagcagagagatatattaaagaccgaactctgccatttcactctgtcatttatcatgaagatgatattaactatccccataaatacggtcctcaggggggctgtgcagatcattcagtatttgaaagaatgaggaaataccagatgactggtgtagaggaagtaacacagatacctcaagaagaacatgctgctaatggtccagaacttctgaggaaaaaacgt。
6、pcr扩增该片段并克隆至pgex-4t-1表达载体，转化bl21de3感受态，使用iptg诱导gst-adam10 pro-domain融合蛋白表达，可以获得融合蛋白表达，但表达量非常低，给下一步蛋白的规模化制备造成了困难。通过对人adam10pro-domain的序列进行分析，我们发现可能有两个主要因素制约该蛋白在e.coli内的翻译效率。一是该序列含有较多的稀有密码子，影响蛋白的翻译效率；二是该序列gc含量偏低，可能影响了mrna的稳定性从而影响翻译效率。
7、所述优化是使用10％-25％的过饱和硫酸铵预沉淀杂质，使用30％-50％的过饱和硫酸铵沉淀adam10 pro-domain重组蛋白。
8、优选的，所述优化是根据密码子的简并性，将adam10 pro-domain序列进行密码子优化，包括以下几个步骤：
9、第一步，将a10 prod oprimized 1和a10 prod oprimized 2分别通过bamhi/xhoi双酶切，酶切之后进行胶回收，然后进行纯化；
10、第二步，通过t4连接酶连接bamhi/xhoi酶切纯化后pgex4t-1载体；
11、第三步，取10ul第二步中获取的pgex4t-1载体，转入jm109感受态细胞，先在冰上放置，然后热激，热激之后在冰上继续冷却，冷却之后加入900ul无amp+lb培养基，并进行37℃摇床培养20—40min，然后涂板，最后在37℃下倒置培养12—16h；
12、第四步，挑取单克隆，并扩大培养，之后提取质粒，然后使用bamhi/xhoi酶切验证，验证完成之后测序；
13、第五步，选取酶切及测序结果均正确的质粒，转入bl21感受态细胞按照第三步进行同样操作；
14、第六步，挑取多个单克隆，扩大培养，进行100μm iptg在25℃下诱导8—10h后，取菌液，进行sds-page电泳，并通过考马斯亮蓝染色观察蛋白表达情况。
15、优选的，所述第一步中酶切的温度为37℃，且酶切完整之后静置过夜。
16、优选的，所述第二步中t4连接酶连接完成之后，将得到的产物在室温下放置30—60min。
17、优选的，所述第三步中转入jm109感受态细胞的含量为100ul。
18、优选的，所述第三步中第一次冰上放置的时间为30—60min，所述热激的温度为42℃，且热激90s，之后再次在冰上冷却的时间为2—3min。
19、优选的，所述第六步中染色观察结束之后，再使用不同浓度过饱和硫酸铵进行盐沉，在选取a10 prod oprimized-1扩大培养后，先进行iptg诱导表达，然后在超声裂解菌液后，选择不同浓度的过饱和硫酸铵盐沉提取蛋白，且分别留取iptg诱导前后，超声裂解后上清及包涵体，并对20％、25％、33％、50％和67％浓度的过饱和硫酸铵盐沉后沉淀及上清样品，进行考马斯亮蓝染色。
20、优选的，所述过饱和硫酸铵盐沉结束之后，进行染色观察，然后选取过饱和硫酸铵浓度在33％—50％之间的沉淀进行进一步的优化处理，先本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人ADAM10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述优化方法是通过同义突变替换掉ADAM10 pro-domain天然序列中的稀有密码子，且通过同义突变平衡编码序列的GC含量；
2.根据权利要求1所述的一种人ADAM10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述优化是根据密码子的简并性，将ADAM10pro-domain序列进行密码子优化，包括以下几个步骤：
3.根据权利要求2所述的一种人ADAM10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述第一步中酶切的温度为37℃，且酶切完整之后静置过夜。
4.根据权利要求2所述的一种人ADAM10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述第二步中T4连接酶连接完成之后，将得到的产物在室温下放置30—60min。
5.根据权利要求2所述的一种人ADAM10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述第三步中转入JM109感受态细胞的含量为100ul。
6.根据权利要求2所述的
7.根据权利要求2所述的一种人ADAM10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述第六步中染色观察结束之后，再使用不同浓度过饱和硫酸铵进行盐沉，在选取A10 prod oprimized-1扩大培养后，先进行IPTG诱导表达，然后在超声裂解菌液后，选择不同浓度的过饱和硫酸铵盐沉提取蛋白，且分别留取IPTG诱导前后，超声裂解后上清及包涵体，并对20％、25％、33％、50％和67％浓度的过饱和硫酸铵盐沉后沉淀及上清样品，进行考马斯亮蓝染色。
8.根据权利要求7所述的一种人ADAM10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述过饱和硫酸铵盐沉结束之后，进行染色观察，然后选取过饱和硫酸铵浓度在33％—50％之间的沉淀进行进一步的优化处理，先使用25％过饱和硫酸铵沉淀杂质，再使用33％-50％过饱和硫酸铵沉淀目的蛋白。
9.根据权利要求8所述的一种人ADAM10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述进一步优化处理包括以下几个步骤：
10.根据权利要求9所述的一种人ADAM10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述S3中混合的时间为30—60min，且混合的温度为室温，所述S5中浓缩的转速为30-45r/min。
...【技术特征摘要】
1.一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述优化方法是通过同义突变替换掉adam10 pro-domain天然序列中的稀有密码子，且通过同义突变平衡编码序列的gc含量；
2.根据权利要求1所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述优化是根据密码子的简并性，将adam10pro-domain序列进行密码子优化，包括以下几个步骤：
3.根据权利要求2所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述第一步中酶切的温度为37℃，且酶切完整之后静置过夜。
4.根据权利要求2所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述第二步中t4连接酶连接完成之后，将得到的产物在室温下放置30—60min。
5.根据权利要求2所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述第三步中转入jm109感受态细胞的含量为100ul。
6.根据权利要求2所述的一种人adam10 pro-domain大肠杆菌表达的优化方法，其特征在于，所述第三步中第一次冰上放置的时间为30—60min，所述热激的温度为42℃，且热激90s，之后再次在冰上冷却的...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈翀，王聪月，陈茜燏，席静静，祁娜，徐开林，
申请(专利权)人：徐州医科大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。