【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种利用酪丁酸梭菌产1,3-丙二醇的方法及应用。
技术介绍
1、1,3-丙二醇(1,3-propanediol，1,3-pdo)是一种重要的大宗化学品，广泛用于药物、化妆品、润滑剂和聚合物等方面的生产。1,3-pdo在聚合物产业方面的应用尤为重要，其可作为单体合成各种聚酯、聚醚、聚氨酯，特别是与对苯二甲酸聚合可生成在地毯、涂料、服装面料等领域应用广泛的新型聚酯纤维——聚对苯二甲酸丙二醇酯(polytrimethyleneterephthalate，ptt)，该材料在拉伸和拉伸恢复方面具有较好的特性。近两年发现，1,3-pdo还可作为添加底物，合成共聚物p(3hb-co-3hp)、p(3hb-co-3hp-co-4hb)、p(3hb-co-3hp-co-5hv)等，使得其应用范围继续得到拓宽。1,3-pdo的潜在市场需求巨大，包括丙烯醛水合加氢法和环氧乙烷羰基化法两种方法在内的化学合成法由于在生产技术方面存在诸多问题以及对环境污染较大，目前正被更绿色环保、更经济的微生物发酵生产取代。而微生物发酵生产1,3-pdo具有条件温和、操作简单、绿色环保等优势，是目前的研究热点以及工业生产的主流。
2、甘油-1,3-pdo和葡萄糖-甘油-1,3-pdo是目前生物发酵生产1,3-pdo中两种主要的路线。甘油-1,3-pdo途径，是某些自然菌株如以甘油为底物直接代谢合成1,3-pdo。肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)、丁酸梭菌(clostridium butyricum)是当前
3、在生物柴油生产过程中会伴随着10％的副产物粗甘油的产生，由于其处理效益问题，大量粗甘油无法得到充分利用而被废弃。而这些廉价的粗甘油可成为生产1,3-pdo的潜在底物来源，不仅可以减少生产1,3-pdo的底物成本，还能防止因其废弃带来的环境污染，促进生物柴油产业的可持续发展。
4、酪丁酸梭菌(clostridium tyrobutyricum)是产丁酸的天然菌株，其代谢副产物少且非致病，加上其遗传背景清晰、遗传操作工具成熟，可被改造生产其他产品，被认为是理想的生产宿主。通过代谢工程，将丁酸梭菌中的非b12依赖的1,3-pdo合成途径引入酪丁酸梭菌，可使其能利用甘油为底物生产1,3-pdo，不仅在将来源充分的粗甘油转化为高价值产品方面具有潜在的应用，还能丰富目前的1,3-pdo生产菌株库。
技术实现思路
1、为了克服现有技术的不足之处，本专利技术的首要目的在于提供一种酪丁酸梭菌重组菌株，含有甘油脱水酶、甘油脱水酶激活因子和1,3-丙二醇脱氢酶。
2、本专利技术的另一目的是提供一种合成1,3-丙二醇的酪丁酸梭菌的制备方法。
3、本专利技术的再一目的在于提供发酵生产高浓度1,3-丙二醇的方法。
4、本专利技术提供的目的通过下述技术方案实现：
5、一种产1,3-丙二醇的酪丁酸梭菌重组菌株的构建方法，通过构建重组表达质粒，在酪丁酸梭菌或其工程菌(clostridium tyrobutyricum)中过表达包含甘油脱水酶基因dhab1，甘油脱水酶激活因子基因dhab2，1,3-丙二醇脱氢酶基因dhat的合成基因簇，获得酪丁酸梭菌重组菌株。
6、优选地，所述基因dhab1，基因dhab2，基因dhat均来自丁酸梭菌(clostridiumbutyricum)。
7、优选地，所述酪丁酸梭菌为c.tyrobutyricum atcc 25755或其工程菌，所述丁酸梭菌为c.butyricum scut343-4。
8、优选地，所述合成基因簇的核酸序列如seq id no:1所示。
9、优选地，所述酪丁酸梭菌工程菌为自身upp基因(ctk_c01410)敲除菌、氢化酶基因hyda(ctk_c05160)敲除工程菌和甘油-3-磷酸脱氢酶基因glpd(ctk_c26520)过表达工程菌中的一种或两种以上。
10、所述酪丁酸梭菌重组菌株的构建方法，具体包括如下步骤：
11、(1)pcr扩增目的基因；
12、(2)目的基因与双酶切载体连接；
13、(3)连接产物转化至大肠杆菌ca434，氯霉素抗性lb平板筛选阳性克隆，获得含重组质粒的的大肠杆菌ca434；
14、(4)通过细菌接合的方式，将重组质粒从大肠杆菌ca434转移至酪丁酸梭菌，获得酪丁酸梭菌重组菌株。
15、所述酪丁酸梭菌重组菌株的应用，利用酪丁酸梭菌重组菌株发酵甘油生产1,3-丙二醇。
16、优选地，所述发酵的培养基成分为：碳源，氮源，1g/l k2hpo4·3h2o，0.5g/lkh2po4，2g/l(nh4)2so4，0.1g/l mgso4﹒7h2o，40g/l caco3；微量元素1:1000(v/v)；微量元素母液：15g/l feso4﹒7h2o，15g/l cacl2﹒2h2o，10g/l mnso4﹒h2o，20g/l cocl2﹒6h2o，20g/lznso4﹒7h2o；所述发酵条件为25～42℃(更优选30～37℃)，50～250rpm，ph 5.5-6.5，接种量为1～20％。
17、优选地，所述碳源为分析纯甘油或工业级粗甘油；所述氮源为蛋白胨、酵母提取物或廉价氮源，包括菜籽油枯、粗鱼粉、黄豆饼粉、花生饼粉或玉米浆。
18、优选地，所述发酵模式为批式发酵或补料发酵(分批补料、流加补料或ph-stat补料)。
19、本专利技术提供的工程菌发酵生产1,3-丙二醇的方法，具体如下：
20、将-80℃冰箱保存的甘油菌接种于cgm种子培养基中，37℃过夜活化，将活化的种子液再次接种于cgm种子培养基中，37℃培养12h，然后将种子液按10％接种于发酵培养基中，37℃，150rpm。
21、所用发酵培养基：
22、梭菌生长培养基(cgm)：，碳源，氮源，1g/l k2hpo4·3h2o，0.5g/l kh2po4，2g/l(nh4)2so4，0.1g/l mgso4﹒7h2o，微量元素1:1000(v/v)；微量元素母液：15g/l feso4﹒7h2o，15g/l cacl2﹒2h2o，10g/l mnso4﹒h2o，20g/l cocl2﹒6h2o，20g/l znso4﹒7h2o。
23、种子培养基：cgm培养基，碳源为20g/l纯甘油，氮源为4g/l蛋白胨和2g/l酵母提取物，充入高纯氮气。
24、发酵培养基：cgm培养基，碳源为50g本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种产1,3-丙二醇的酪丁酸梭菌重组菌株的构建方法，其特征在于，通过构建重组表达质粒，在酪丁酸梭菌或其工程菌(Clostridium tyrobutyricum)中过表达包含甘油脱水酶基因dhaB1，甘油脱水酶激活因子基因dhaB2，1,3-丙二醇脱氢酶基因dhaT的合成基因簇，获得酪丁酸梭菌重组菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因dhaB1，基因dhaB2，基因dhaT均来自丁酸梭菌(Clostridium butyricum)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酪丁酸梭菌为C.tyrobutyricum ATCC25755或其工程菌，所述丁酸梭菌为C.butyricum SCUT343-4。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述合成基因簇的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述酪丁酸梭菌工程菌为自身upp基因敲除菌、氢化酶基因hydA敲除工程菌和/或甘油-3-磷酸脱氢酶基因glpD过表达工程菌中的一种或两种以上。
...【技术特征摘要】
1.一种产1,3-丙二醇的酪丁酸梭菌重组菌株的构建方法，其特征在于，通过构建重组表达质粒，在酪丁酸梭菌或其工程菌(clostridium tyrobutyricum)中过表达包含甘油脱水酶基因dhab1，甘油脱水酶激活因子基因dhab2，1,3-丙二醇脱氢酶基因dhat的合成基因簇，获得酪丁酸梭菌重组菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因dhab1，基因dhab2，基因dhat均来自丁酸梭菌(clostridium butyricum)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述酪丁酸梭菌为c.tyrobutyricum atcc25755或其工程菌，所述丁酸梭菌为c.butyricum scut343-4。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述合成基因簇的核酸序列如seq id no:1所示。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述酪丁酸梭菌工程菌为自身upp基因敲除菌、氢化酶基因hyda敲除工程菌和/或甘油-3-磷酸脱氢酶基因glpd过表达工程菌中的一种或两...
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