【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疫苗，具体地，涉及一种疫苗佐剂及其筛选方法。
技术介绍
1、随着疫苗制备技术的不断发展，抗原纯化技术的不断完善，现在技术通常使用的疫苗一般为灭活抗原或者重组抗原，疫苗抗原的特异性增强，但免疫原性逐渐下降。要解决“免疫原性低”这个问题，不能简单地增加疫苗中抗原数量，抗原数量的增加往往会伴随着难以处理的不良反应。因此，疫苗佐剂应运而生，能够允许以更少的抗原剂量达到复合免疫标准的保护效果。
2、佐剂(adjuvant)的添加能够改善和增强疫苗抗原的免疫原性，扩大疫苗抗原引起的免疫反应，帮助疫苗抗原产生更强的免疫应答，从而在更少的疫苗抗原的添加量的情况下获得更高的免疫原性。除此之外，佐剂还能够实现免疫反应的定性改变，如使用不同的佐剂，可能引起不同的固有免疫信号通路，从而影响辅助性t细胞(th)的极化。
3、目前，最常见的疫苗佐剂包括铝佐剂和油乳佐剂，但这些佐剂由于本身的特性限制了其作为佐剂的发展，例如，铝佐剂不能低温冻存加大了运输和储备难度；弗氏佐剂毒性太大不能用于人体。因此，新型佐剂的筛选成为免疫学领域中具有重要意义，能够解决目前佐剂类型单一、使用受限等问题。另一方面，现有技术中已经有皂苷类的免疫刺激复合物(iscoms)、模式识别受体(prr)激动剂(如poly ic、cpg)等等，如中国专利技术专利cn113827740a公开的一种水溶性复合疫苗佐剂的筛选方法，通过利用ova+iscom作为复合佐剂来提高佐剂的免疫效力；中国专利技术专利cn105924525a利用重组tlr4蛋白(抗原)与弗氏
4、纳米材料由于其优越的物理化学特性，广泛应用于生物学领域。作为佐剂，纳米材料易于修饰的表面特性使其可与多种免疫刺激剂或者抗原结合，能够渗入到组织深部并且加强细胞摄取以及避开溶酶体腔室，同时促进该类细胞对抗原的捕获与提呈，以实现对t细胞的活化和刺激，发挥更好的免疫效应，在这一过程中，抗原提呈细胞的活化和抗原的有效提呈十分关键，也是目前设计纳米佐剂的关键点。锰离子、锌离子、镁离子等在机体的免疫调控中有关键性作用，结合纳米技术，金属氧化物纳米材料通过与抗原的相互作用能负载抗原以促进抗原提呈细胞对抗原的捕获，进而能发挥更好、更长久的免疫调节作用。但是，现有技术佐剂的筛选方法主要为小鼠体内免疫筛选的方法，而小鼠体内免疫筛选的方法，耗时耗力且成本较高，且这个筛选周期较长，对疫苗佐剂的开发在经济角度上具有极大的限制性作用，且现有的佐剂大多无法识别其发挥作用的免疫信号通路的调节手段。
5、因此，本专利技术提供一种疫苗佐剂的筛选方法，利用细胞实验筛选法缩短筛选周期、降低成本，同时，采用该筛选方法来筛选出具有安全系数高的佐剂。以纳米金属氧化物作为目标，进行细胞毒性实验，排除细胞毒性过大、实际使用容易损害机体的金属氧化物。
技术实现思路
1、本专利技术提供一种疫苗佐剂及其筛选方法，通过细胞实验筛选法来替代小鼠体内免疫筛选法，在解决筛选周期过长问题的同时，提供具有高安全系数的氧化物佐剂，且能够进一步地识别该佐剂发挥作用的信号通路。
2、本专利技术提供的疫苗佐剂的筛选方法，包括采用细胞筛选方法，分别对待筛选佐剂的细胞毒性、发挥作用的信号通路进行筛选和报告，得到具有引起固有免疫反应的疫苗佐剂。
3、具体地，所述细胞筛选方法包括对待筛选佐剂进行细胞毒性实验进行初步筛选，再通过作为宿主细胞对所述待筛选佐剂的发挥作用的通路进行二次筛选得到所述疫苗佐剂；最后，再通过小鼠体内免疫实验进行免疫功能验证。
4、更具体地，包括采用细胞筛选的方法，是以小鼠单核巨噬细胞白血病细胞作为毒性检测细胞和表达nf-κb和/或ird信号通路的thp1-dual细胞为宿主细胞；通过对待筛选佐剂的细胞毒性以及信号通路的作用进行检测，得到具有引起固有免疫反应的疫苗佐剂；最后，利用小鼠体内免疫实验进行免疫功能验证。
5、作为一种优选地实施方式，毒性检测细胞为raw264.7细胞，它是机体重要的免疫细胞，能够吞噬并杀伤多种入侵的病原微生物，同时激活淋巴细胞或其他免疫细胞，激活机体的免疫响应。
6、优选地，所述细胞毒性实验包括通过酶标仪检测细胞存活率。
7、优选地，所述小鼠体内免疫实验包括小鼠特异性igg的效价的测试以及黑色素瘤抑制实验。
8、优选地，所述细胞毒性实验中，将毒性筛选细胞加入至含有所述待筛选佐剂的培养基中进行培养，再进行细胞裂解，然后通过细胞活率检测来判断所述待筛选佐剂的细胞毒性，得到初步筛选佐剂。
9、优选地，所述的细胞活率检测采用荧光素酶系统的细胞活力检测试剂；通过细胞裂解，释放atp激发试剂中的荧光信号，根据发光强度与atp量成正比关系，对活细胞数目进行定量检测。
10、作为一种优选的实施方式，所述细胞活力检测试剂为2.0luminescent cell viability assay。
11、优选地，将所述初步筛选佐剂在宿主细胞中进行验证所述宿主细胞能否稳定表达完整的nf-κb和/或ird信号通路。
12、优选地，所述初步筛选佐剂对nf-κb和/或ird信号通路的诱导情况的验证方法通过检测酶活性的方法进行验证；所述检测酶活性的方法包括将所述宿主细胞中加入所述初步筛选佐剂，进行孵育后得到上清液；采用比色酶分析法，利用所述宿主细胞中的胚胎碱性磷酸酶(seap)或荧光素酶活性进行对比判断，在所述上清液中加入quanti-blue溶液或quanti-luc溶液，并于阳性对照组进行对比，和/或，所述阳性对照组为脂多糖(lps)阳性对照组。
13、优选地，所述毒性筛选细胞为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞；所述宿主细胞为表达nf-κb和/或ird信号通路的thp1-dual细胞。
14、优选地，所述待筛选佐剂为纳米金属氧化物；其能够以纳米颗粒形式作为载体，能大量负载抗原，包括氧化锌、四氧化三铁、氧化钴和氧化锰。
15、本专利技术实现的原理包括通过筛选的疫苗佐剂来刺激固有免疫反应通过刺激抗原提呈细胞(apc)上模式识别受体(prr)从而激活下游nf-κb或者irf信号通路来完成(参见takeuchi and s akira，pattern recognition receptors andinflammation.cell.2010，805-820)。本专利技术使用的nf-κb报告细胞和irf报告细胞，这两个报告细胞所涉及的两个信号通路nf-κb信号通路和irf信号通路均与固有免疫反应的激活相关，因此，筛选出的佐剂如果通过能够诱导nf-κb信号通路和/或irf信号通路，即可确认是否能够发生固有免疫反应，从而判定筛选的疫苗佐剂是否能够具有免疫刺激性。
<本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，采用细胞筛选方法，分别对待筛选佐剂的细胞毒性、发挥作用的信号通路进行筛选和报告，得到具有引起固有免疫反应的疫苗佐剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，所述细胞筛选方法包括对待筛选佐剂进行细胞毒性实验进行初步筛选，再通过作为宿主细胞对所述待筛选佐剂的发挥作用的通路进行二次筛选得到所述疫苗佐剂；最后，再通过小鼠体内免疫实验进行免疫功能验证。
3.根据权利要求2所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，所述细胞毒性实验包括通过酶标仪检测细胞存活率；和/或，所述小鼠体内免疫实验包括小鼠特异性IgG的效价的测试以及黑色素瘤抑制实验。
4.根据权利要求3所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，所述细胞毒性实验中，将毒性筛选细胞加入至含有所述待筛选佐剂的培养基中进行培养，再进行细胞裂解，然后通过细胞活率检测来判断所述待筛选佐剂的细胞毒性，得到初步筛选佐剂。
5.根据权利要求4所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，所述的细胞活率检测采用荧光素酶系统的细胞活力检测试剂；通过细胞裂解，释放ATP
6.根据权利要求2所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，将所述初步筛选佐剂在宿主细胞中进行验证所述宿主细胞能否稳定表达完整的NF-κB和/或IRD信号通路。
7.根据权利要求6所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，所述初步筛选佐剂对NF-κB和/或IRD信号通路的诱导情况的验证方法通过检测酶活性的方法进行验证；所述检测酶活性的方法包括将所述宿主细胞中加入所述初步筛选佐剂，进行孵育后得到上清液；采用比色酶分析法，利用所述宿主细胞中的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)或荧光素酶活性进行对比判断，在所述上清液中加入QUANTI-Blue溶液或QUANTI-Luc溶液，并于阳性对照组进行对比，和/或，所述阳性对照组为脂多糖(LPS)阳性对照组。
8.根据权利要求2-7任一项所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，所述毒性筛选细胞为小鼠单核巨噬细胞白血病细胞；所述宿主细胞为表达NF-κB和/或IRD信号通路的THP1-Dual细胞。
9.根据权利要求1-7任一项所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，所述待筛选佐剂为纳米金属氧化物。
10.一种疫苗佐剂，采用如权利要求1-9任一项所述的筛选方法筛选得到，包括四氧化三铁纳米佐剂。
...【技术特征摘要】
1.一种疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，采用细胞筛选方法，分别对待筛选佐剂的细胞毒性、发挥作用的信号通路进行筛选和报告，得到具有引起固有免疫反应的疫苗佐剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，所述细胞筛选方法包括对待筛选佐剂进行细胞毒性实验进行初步筛选，再通过作为宿主细胞对所述待筛选佐剂的发挥作用的通路进行二次筛选得到所述疫苗佐剂；最后，再通过小鼠体内免疫实验进行免疫功能验证。
3.根据权利要求2所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，所述细胞毒性实验包括通过酶标仪检测细胞存活率；和/或，所述小鼠体内免疫实验包括小鼠特异性igg的效价的测试以及黑色素瘤抑制实验。
4.根据权利要求3所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，所述细胞毒性实验中，将毒性筛选细胞加入至含有所述待筛选佐剂的培养基中进行培养，再进行细胞裂解，然后通过细胞活率检测来判断所述待筛选佐剂的细胞毒性，得到初步筛选佐剂。
5.根据权利要求4所述的疫苗佐剂的筛选方法，其特征在于，所述的细胞活率检测采用荧光素酶系统的细胞活力检测试剂；通过细胞裂解，释放atp激发试剂中的荧光信号，根据发光强度与atp量成正比关系，对活细胞数目进行定量检测。
【专利技术属性】
技术研发人员：李炯，郑雪雯，濮科锋，李娜娜，陈艳花，
申请(专利权)人：中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所，
类型：发明
国别省市：
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