【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于魔芋根际微生物群落分析，尤其涉及一种不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法。
技术介绍
1、目前，魔芋(amorphophallus spp.)是天南星科多年生草本植物，可积累大量的葡甘聚糖(kgm)，用于食品、化工和制药工业。我国是世界上最大的魔芋生产国，占世界总产量的60％。但是，由pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum(pcc)引起的细菌性软腐病严重制约着我国魔芋的栽培和kgm的生产。pcc侵染魔芋植株的所有部分(叶片、叶柄以及块茎)，通常产生叶片黄化和萎蔫、叶柄内部组织及地下球茎软腐的症状，随后全株死亡。田间平均发病率35％以上，可造成魔芋减产达30-70％，甚至大面积绝收。除魔芋外，pcc还可在世界各地的多种植物宿主上引起广泛的疾病，包括香蕉、马铃薯、洋百合、莴苣、大白菜等的软腐病。但是关于它的防治一直是生产上的难题。
2、目前，魔芋软腐病的防治主要以化学药剂防治以及农业防治为主，包括换地轮作、种芋消毒、土壤消毒等。毫无疑问它们都有一定的局限性，不能够根除软腐病。因此，抗病品种的利用被认为是预防软腐病最有希望的策略之一。珠芽魔芋(amorphophallusmuelleri)是一类特殊的能利用实生籽种(三倍体无融合生殖2n＝39)进行繁殖的商业化品种，与传统栽培的花魔芋、白魔芋相比具有繁殖系数大、产量高、高抗软腐病等特点。先前的研究从生理学、抗病基因等方面阐述了a.muelleri软腐病防御的分子机制，但在明确a.muelleri抗
3、土传病害的发生与土壤微生态系统失衡密切相关，土壤理化性质、气候条件、地理位置和根际微生物多样性均对土传病害的发生起着重要作用。其中，根际土壤微生物作为根际土壤微生态环境中生理活性最强的部分近年来备受关注。mendes和dong等指出植物中的大多数抗病和发育机制与根际微生物的多样性直接相关。同时，植物基因型和土壤类型是组成健康根际微生物群的两个重要因素。
4、通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术缺乏不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应机制不同的分析。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法。
2、本专利技术是这样实现的，一种不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法，所述不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法通过16s rrna和18s rrna高通量测序分析，对不同抗性魔芋的pcc侵染以及健康植株的根际细菌、真菌群落进行了评价，并通过picrust预测细菌群落功能。
3、进一步，所述不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法，包括以下步骤：
4、第一步，选择在温室生长5个月后的健康a.konjac和a.muelleri植株，将100μl的pcc菌液(1×108cfu/ml)接种于叶柄基部1-2cm处，同时接种等量的无菌水作为对照；
5、第二步，参照spin kit for soil土壤基因组dna提取试剂盒的步骤提取各根际土壤样品dna，dna浓度和纯度利用nanodrop2000进行检测，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测dna提取质量；
6、第三步，原始测序序列使用trimmomatic软件质控，用flash软件进行序列拼接；通过usearch软件过滤得到的序列，并去除嵌合体序列得到有效序列。
7、进一步，所述不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法使用的软腐病病原菌pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum菌株ecck-23b已保存；将菌株活化后，接种到luria-bertani肉汤，胰蛋白10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l和ph 7.0±0.2)中摇培过夜，然后用无菌蒸馏水稀释至细胞浓度为1×108cfu/ml，用于接种植物。
8、进一步，所述不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法选择两个不同抗性魔芋品种：a.konjac和a.muelleri，其中a.muelleri对pcc表现为高抗性，a.konjac为高感；选择两个魔芋品种的1年生地下球茎，种植于同一温室中，在光照、温度、浇水和施肥条件相同的条件下生长的魔芋植株作为供试材料。
9、进一步，所述第一步中共包括共4个处理，每个处理3次重复，每次重复包含3株接种植株。
10、进一步，在pcc侵染的a.konjac植株表现出明显的发病症状时对所有处理组进行取样，去除表层土后将各处理植株整株拔起，抖落较松散的土壤后收集附着在根上0～4mm的土壤作为根际土，每次重复中的3株魔芋植株根际土壤被混在一起作为一个样品，共12个样品，各处理组分别命名为：ak_ck(a.konjac接种无菌水)，ak_pcc(a.konjac接种pcc)，am_ck(a.muelleri接种无菌水)，am_pcc(a.muelleri接种pcc)。
11、进一步，所述第二步中细菌用通用引物338f(5'-actcctacgggaggcagcag-3')和806r(5'-ggactachvgggtwtctaat-3')扩增16s rrna基因的v3-v4区进行多样性分析。
12、进一步，用通用引物ts1 f(5’-acttggtcatttagaggaagtaa-3’)和its2r(5’-bgctgcgttcttcatcgatgc-3’)对真菌多样性进行分析；pcr扩增程序使用2％琼脂糖凝胶回收pcr产物，并根据制造商的说明使用axyprep dna gel extraction kit试剂盒进一步纯化后，送上海美吉生物医药科技有限公司在illumina miseq pe300平台进行测序。
13、进一步，所述第三步中用uparse软件在97％的相似性水平上划分操作分类单元；代表序列用rdp classifier软件和silva数据库进行物种注释，利用mothur软件作稀释度曲线，计算文库覆盖率coverage，shannon、simpson、ace及chao1指数，对物种的多样性和丰富度指数进行评价，利用qiime软件建立的bray-curtis距离算法进行主坐标分析pcoa，circos图是使用circos-0.67-7软件构建的。
14、进一步，线性判别分析lda结合效应大小测量lefse分析用于使用lefse软件搜索不同处理之间的统计学上不同的生物标志物；使用picrust软件对各样本细菌群体进行功能预测。
15、结合上述的技术方案和解决的技术问题，本专利技术所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
16、第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本专利技术的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法，其特征在于，所述不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法通过16S rRNA和18SrRNA高通量测序分析，对不同抗性魔芋的Pcc侵染以及健康植株的根际细菌、真菌群落进行了评价，并通过PICRUSt预测细菌群落功能。
2.如权利要求1所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法，其特征在于，所述不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法，其特征在于，所述不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法使用的软腐病病原菌Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum菌株EccK-23B已保存；将菌株活化后，接种到Luria-Bertani肉汤，胰蛋白10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 5g/L和pH 7.0±0.2)中摇培过夜，然后用无菌蒸馏水稀释至细胞浓度为1×108CFU/mL，用于接种植物。
4.如权利要求2所述的
5.如权利要求2所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法，其特征在于，所述第一步中共包括共4个处理，每个处理3次重复，每次重复包含3株接种植株。
6.如权利要求5所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法，其特征在于，在Pcc侵染的A.konjac植株表现出明显的发病症状时对所有处理组进行取样，去除表层土后将各处理植株整株拔起，抖落较松散的土壤后收集附着在根上0～4mm的土壤作为根际土，每次重复中的3株魔芋植株根际土壤被混在一起作为一个样品，共12个样品，各处理组分别命名为：AK_CK(A.konjac接种无菌水)，AK_PCC(A.konjac接种Pcc)，AM_CK(A.muelleri接种无菌水)，AM_PCC(A.muelleri接种Pcc)。
7.如权利要求2所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法，其特征在于，所述第二步中细菌用通用引物338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')扩增16S rRNA基因的V3-V4区进行多样性分析。
8.如权利要求7所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法，其特征在于，用通用引物TS1 F(5’-ACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R(5’-BGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)对真菌多样性进行分析；PCR扩增程序使用2％琼脂糖凝胶回收PCR产物，并根据制造商的说明使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit试剂盒进一步纯化后，送上海美吉生物医药科技有限公司在Illumina Miseq PE300平台进行测序。
9.如权利要求2所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法，其特征在于，所述第三步中用Uparse软件在97％的相似性水平上划分操作分类单元；代表序列用RDP classifier软件和SILVA数据库进行物种注释，利用Mothur软件作稀释度曲线，计算文库覆盖率Coverage，Shannon、Simpson、ACE及Chao1指数，对物种的多样性和丰富度指数进行评价，利用Qiime软件建立的Bray-Curtis距离算法进行主坐标分析PCoA，Circos图是使用Circos-0.67-7软件构建的。
10.如权利要求9所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对Pcc侵染响应分析方法，其特征在于，线性判别分析LDA结合效应大小测量LEfSe分析用于使用LEfSe软件搜索不同处理之间的统计学上不同的生物标志物；使用PICRUSt软件对各样本细菌群体进行功能预测。
...【技术特征摘要】
1.一种不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法，其特征在于，所述不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法通过16s rrna和18srrna高通量测序分析，对不同抗性魔芋的pcc侵染以及健康植株的根际细菌、真菌群落进行了评价，并通过picrust预测细菌群落功能。
2.如权利要求1所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法，其特征在于，所述不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法，包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法，其特征在于，所述不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法使用的软腐病病原菌pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum菌株ecck-23b已保存；将菌株活化后，接种到luria-bertani肉汤，胰蛋白10g/l、酵母提取物5g/l、nacl 5g/l和ph 7.0±0.2)中摇培过夜，然后用无菌蒸馏水稀释至细胞浓度为1×108cfu/ml，用于接种植物。
4.如权利要求2所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法，其特征在于，所述不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法选择两个不同抗性魔芋品种：a.konjac和a.muelleri，其中a.muelleri对pcc表现为高抗性，a.konjac为高感；选择两个魔芋品种的1年生地下球茎，种植于同一温室中，在光照、温度、浇水和施肥条件相同的条件下生长的魔芋植株作为供试材料。
5.如权利要求2所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法，其特征在于，所述第一步中共包括共4个处理，每个处理3次重复，每次重复包含3株接种植株。
6.如权利要求5所述的不同抗性魔芋根际微生物群落对pcc侵染响应分析方法，其特征在于，在pcc侵染的a.konjac植株表现出明显的发病症状时对所有处理组进行取样，去除表层土后将各处理植株整株拔起，抖落较松散的土壤后收集附着在根上0～4mm的土壤作为根际土，每次重复中的3株魔芋植株根际土壤被混在一起...
【专利技术属性】
技术研发人员：余磊，黄飞燕，郭建伟，齐颖，赵永腾，高鹏华，李丽芳，杨敏，刘佳妮，陈泽斌，余亚军，林登智，寸德馨，
申请(专利权)人：昆明学院，
类型：发明
国别省市：
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