【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病原体检测。更具体地，涉及一种解脲脲原体的数字pcr检测引物和探针组合及其试剂盒。
技术介绍
1、解脲脲原体(ureaplasma，uu)为柔膜体纲，支原体目，支原体科，脲原体属中的一个种，是一类无细胞壁的原核细胞微生物，呈球形，细胞器极少，因生长需要尿素而得名。2007年，国际细菌学分类学会将解脲脲原体(uu)的两个生物群定义为两个新的种，即微小脲原体(ureaplasma parvum，upa生物ⅰ群)和解脲脲原体(ureaplasma urealyticum，uur生物ⅱ群)。其中，upa生物ⅰ群包括1、3、6、14共4个血清型，uur生物ⅱ群包括2、4、5、7、8、9、10、11、12、13共10个血清型。
2、uu是人类泌尿生殖道常见的条件致病病原体，通常寄居在泌尿生殖道的表面，感染者多无显著临床症状，缺乏较为特异的临床表现。有报道显示，健康育龄妇女的uu携带率在70％以上，我国健康女性的uu携带率为10％～40％。当机体免疫力降低、受到侵袭性操作或被其他病原体感染侵袭时，uu会突破粘膜层，引起非淋菌性尿道炎和其它多种泌尿生殖道疾病，如前列腺炎、附睾炎等疾病，还会引发不育症、自发流产，导致新生儿分娩时产道感染。uu的携带量是衡量其致病性的重要指标。因此，相比于对uu进行定性检测，对其进行准确的定量检测更有利于对uu相关疾病的预防和治疗。
3、目前，可对uu进行定量检测的方法有实时荧光定量pcr和数字pcr(ddpcr)两种。其中，实时荧光定量pcr需依赖标准曲线，对低拷贝数的靶基因
技术实现思路
1、本专利技术针对上述现有技术中存在的不足，提供了一种解脲脲原体的数字pcr检测引物和探针组合及其试剂盒，实现了对解脲脲原体灵敏、特异、准确的检测。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种解脲脲原体的数字pcr检测引物和探针组合。
3、本专利技术的第二个目的是提供所述数字pcr检测引物和探针组合在制备解脲脲原体的检测产品中的应用。
4、本专利技术的第三个目的是提供一种解脲脲原体的检测试剂盒。
5、本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
6、本专利技术分析比对了不同解脲脲原体(包括14种不同的血清型)的基因组序列，基于比对结果，通过设计优化得到了一种解脲脲原体的数字pcr检测引物和探针组合。在微滴式数字pcr技术的基础上，利用本专利技术所述数字pcr检测引物和探针组合可以实现对解脲脲原体的定量检测且检测结果准确。
7、具体地，使用微滴阅读仪检测每个微滴的荧光水平可判断微滴的阴阳性，统计所有微滴的阴阳性情况后，即可判断样本中是否存在解脲脲原体核酸，实现对解脲脲原体的定性检测。根据阴阳性微滴的统计结果，结合统计学公式，可进一步计算样本中解脲脲原体核酸的拷贝数，实现对解脲脲原体的定量检测。
8、本专利技术提供了一种解脲脲原体的数字pcr检测引物和探针组合，包括用于检测解脲脲原体的数字pcr引物对和探针；所述数字pcr引物对的核苷酸序列如seq id no.1～2所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
9、具体地，所述解脲脲原体包括其14种不同的血清型。
10、作为其中的一种实施方式，用于检测解脲脲原体的探针的5’端标记的荧光基团为fam，3’端标记的淬灭基团为mgb。
11、为避免假阴性问题，本专利技术所述解脲脲原体的数字pcr检测引物和探针组合中还包括用于检测内标基因的数字pcr引物对和探针；所述数字pcr引物对的核苷酸序列如seqid no.3～4所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；所述荧光基团与用于检测解脲脲原体的探针上标记的不同。
12、作为其中的一种实施方式，用于检测内标基因的探针的5’端标记的荧光基团为vic，3’端标记的淬灭基团为mgb。
13、利用本专利技术所述数字pcr检测引物和探针组合，可以实现对解脲脲原体的定量检测。因此，本专利技术请求保护所述数字pcr检测引物和探针组合在制备解脲脲原体的检测产品中的应用。
14、可选地，所述检测产品包括定性或定量检测产品。
15、本专利技术还提供了一种解脲脲原体检测试剂盒。
16、具体地，所述试剂盒中含有引物探针预混液和数字pcr反应所需试剂；所述引物探针预混液中含有本专利技术所述数字pcr检测引物和探针组合。
17、具体地，所述数字pcr反应所需试剂为微滴式数字pcr反应所需试剂。
18、具体地，本专利技术配制引物探针预混液所用试剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
19、本专利技术所述试剂盒中还含有阳性质控品和阴性质控品。
20、具体地，所述阳性质控品中含有所检测的解脲脲原体的核酸片段(基因序列)和内标基因序列。
21、可选地，所述阳性质控品为含有所检测的解脲脲原体的核酸片段和内标基因序列重组质粒或假病毒。
22、具体地，所述阴性质控品中含内标基因序列。
23、可选地，所述阴性质控品为仅含内标基因序列的重组质粒或假病毒。
24、本专利技术还提供了一种利用本专利技术所述试剂盒定量检测解脲脲原体的方法，包括以下步骤：
25、s1.提取待测样本核酸；
26、s2.以s1所得样本核酸为模板，配制数字pcr反应体系；
27、s3.数字pcr检测。
28、可选地，所述样本为尿生殖道分泌物。
29、具体地，配制反应体系所用试剂除引物探针预混液外，还有适用于dna样本的微滴式数字pcr预混液(ddpcrtm supermix for probes(no dutp)，bio-rad)。
30、具体地，反应体系(单人份)为：6μl引物探针预混液，11μl ddpcrtm supermix forprobes(no dutp)和5μl样本核酸(或阳性质控品/阴性质控品)。
31、具体地，反应体系中用于检测解脲脲原体和内标基因的数字pcr引物对的上下游引物的终浓度范围为0.3～0.6μmol/l，用于检测解脲脲原体和内标基因的探针的终浓度范围为0.15～0.35μmol/l。
32、当反应体系中用于检测解脲本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种解脲脲原体的数字PCR检测引物和探针组合，其特征在于，包括用于检测解脲脲原体的数字PCR引物对和探针；所述数字PCR引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述数字PCR检测引物和探针组合，其特征在于，用于检测解脲脲原体的探针的5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB。
3.根据权利要求1所述数字PCR检测引物和探针组合，其特征在于，还包括用于检测内标基因的数字PCR引物对和探针；所述数字PCR引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～4所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；所述荧光基团与用于检测解脲脲原体的探针上标记的不同。
4.根据权利要求3所述数字PCR检测引物和探针组合，其特征在于，用于检测内标基因的探针的5’端标记的荧光基团为VIC，3’端标记的淬灭基团为MGB。
5.权利要求1～4任一所述
6.一种解脲脲原体的检测试剂盒，其特征在于，含有引物探针预混液和数字PCR反应所需试剂；所述引物探针预混液中含有权利要求1～4任一所述数字PCR检测引物和探针组合。
7.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，配制引物探针预混液所用试剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
8.根据权利要求6所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还含有阳性质控品和阴性质控品。
9.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品中含有所检测的解脲脲原体的核酸片段和内标基因序列。
10.根据权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品中含内标基因序列。
...【技术特征摘要】
1.一种解脲脲原体的数字pcr检测引物和探针组合，其特征在于，包括用于检测解脲脲原体的数字pcr引物对和探针；所述数字pcr引物对的核苷酸序列如seq id no.1～2所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
2.根据权利要求1所述数字pcr检测引物和探针组合，其特征在于，用于检测解脲脲原体的探针的5’端标记的荧光基团为fam，3’端标记的淬灭基团为mgb。
3.根据权利要求1所述数字pcr检测引物和探针组合，其特征在于，还包括用于检测内标基因的数字pcr引物对和探针；所述数字pcr引物对的核苷酸序列如seq id no.3～4所示，所述探针的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团；所述荧光基团与用于检测解脲脲原体的探针上标记的不同。
4.根据权利要求3所述数...
【专利技术属性】
技术研发人员：王世东，蒋析文，陈书容，杨晓雯，黄志文，
申请(专利权)人：广州达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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