【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，更具体的，涉及特异性地靶向cd7的单域抗体、使用该单域抗体构建得到的靶向cd7的嵌合抗原受体、包含此类嵌合抗原受体的工程化的免疫效应细胞，及其在制备用于诊断、预防和/或治疗疾病的药物中的用途。
技术介绍
1、t细胞恶性肿瘤是一类来源于t细胞的淋巴系统恶性肿瘤，通常表达t细胞特征性抗原。who分类将t细胞肿瘤分为t淋巴细胞白血病、t淋巴母细胞性淋巴瘤和成熟t细胞肿瘤。目前针对t细胞恶性肿瘤尚无非常有效的治疗手段，主要治疗方案为化疗，必要时需联合造血干细胞移植，但其在患者中仍具有很高的复发率和死亡率。例如，t细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)，是一种t淋巴细胞异常增生造成的血液疾病，病程进展迅速，可以在短期内快速浸润到淋巴结、肝、脾、中枢神经系统和睾丸等组织器官，需要及时有效的治疗，否则患者的病情会在短期内加重甚至威胁生命。成年人和儿童急性t淋巴细胞白血病接受大剂量化疗的5年生存率分别约为50％和75％。t细胞淋巴瘤是t细胞的一种恶性肿瘤，可在淋巴组织(如淋巴结和脾脏))中或在淋巴组织之外(如胃肠道，肝脏，鼻腔，皮肤等)发展，约占非霍奇金淋巴瘤发病率的10％～15％，在我国该比例更高。外周t细胞淋巴瘤接受以chop方案(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)为基础的化疗且通过自体造血干细胞移植巩固的无进展生存率约为40％-50％。其中早期前体t急性淋巴细胞白血病的亚组预后较差，中位生存时间只有20个月。急性髓系白血病(aml)是一种非常难治的侵袭性造血干细胞恶性肿瘤，容易复发，且占全部患者大多数的老年患
2、cd7(t细胞抗原7)，又称作gp40、tp41、leu-9，是一种40kda的单链跨膜糖蛋白分子，包含有240个氨基酸。cd7通常表达于85％的外周血t细胞和nk细胞及其前体细胞，是一种辅助t细胞活化以及与其他免疫亚群细胞相互作用的共刺激受体蛋白。cd7在大多数的t细胞、nk细胞、髓细胞、t细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴瘤、急性粒细胞性白血病和慢性粒细胞白血病的肿瘤细胞中均有表达，尤其在大多数的t细胞急性淋巴细胞白血病和部分的t细胞急性髓系白血病的肿瘤细胞中高表达，这使得cd7有望成为治疗白血病和淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤的潜力治疗靶点。
3、单域抗体(single-domain antibody,sdab)是只由重链抗体的可变区氨基酸组成的抗体，因而不同于传统的4链抗体，其分子量仅有12-15kda，又被称为纳米抗体。骆驼科动物和鲨鱼产生天然缺乏轻链的抗体，其被称为仅含重链的抗体，或简称为重链抗体(hcab)，骆驼科动物重链抗体的每个臂中的抗原结合片段具有单个重链可变域，被称为重链单域抗体(variabledomain of heavy chain of heavy-chainantibody,vhh)。单域抗体具备与传统抗体相似或更高的特异性和亲和力，此外，还具有可溶性好、稳定性高、穿透力强、结合表位广的天然优势，这些优点使其在免疫治疗领域备受关注，也正在被应用于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、抗感染等疾病治疗方面。
4、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)修饰的t细胞作为一种免疫治疗策略，在许多实体肿瘤、血液系统肿瘤，尤其是淋巴细胞肿瘤的治疗中受到广泛的应用。嵌合抗原受体是一种重组多肽构建体，其代表性结构由细胞外抗原结合结构域(通常为具有抗原识别功能的单链抗体)、铰链区、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域四部分组成。通常根据细胞内信号传导结构域是否加入共刺激分子以及加入的数量，将经典的嵌合抗原受体结构分为第一代(无共刺激分子)、第二代(包含一种共刺激分子)和第三代(包含两种共刺激分子)。截止目前，第二代嵌合抗原受体结构设计在上市产品和临床研究阶段中应用最多。嵌合抗原受体的原理为通过基因工程修饰，使t细胞表达可以特异性识别肿瘤细胞表面抗原的受体结构(例如，单链抗体)，并在该受体与肿瘤细胞表面抗原特异性结合后，激活其下游的免疫共刺激分子和t细胞，突破主要组织相容性复合体(mhc)的限制性，直接特异性识别并杀伤肿瘤细胞，实现靶向清除恶性肿瘤的目的。由于这一识别与杀伤功能的实现需要使用结合活性好、结合表位高效的抗体，因此car-t细胞疗法成功与否的关键之一在于筛选特异性好、结合力强、结合表位有效的高亲和力抗体。
5、因此，目前仍有广泛的需求去筛选和开发改进的靶向cd7的单域抗体、使用其构建的靶向cd7的嵌合抗原受体以及工程化的免疫效应细胞。特别是，开发适用于更有效以及更高效的car-t细胞疗法的稳定靶向cd7的单域抗体。
6、另一方面，由于cd7抗原表达在t细胞表面，进而car-t细胞本身也存在cd7的表达，因此在制备靶向cd7的car-t细胞的过程中，会发生car-t细胞的自相残杀的现象，导致收获的car-t细胞在体外扩增困难。为解决该“自杀”现象造成的靶向cd7的car-t细胞体外扩增难的问题，目前的解决方案包括：
7、(1)通过cd7阻断剂阻断t细胞内源性cd7在细胞表面表达，如专利cn110760007b中公开的相关技术方案。该专利构建了能够阻断t细胞表面cd7表达的cd7阻断载体，通过将cd7蛋白截留在内质网和高尔基体上，阻止cd7在t细胞表面表达，进而避免靶向cd7的car-t细胞的自杀现象。
8、(2)寻找新的cd7结合表位，如专利cn114716564b中公开的相关技术方案。该专利将sectm1的胞外域的特定区段(29-145位氨基酸序列)作为嵌合抗原受体的胞外结合域来构建car-t细胞。据专利记载，在该car-t细胞的制备过程中虽然细胞增殖受到一定影响，但仍可成功大量制备所需的car-t细胞。
9、(3)通过基因编辑方法敲除t细胞的内源性cd7分子，如专利申请cn112300282a中公开的相关技术方案。该方案为了避免car-t细胞之间的互相杀伤，通过crispr/cas9系统敲除t细胞中的cd7基因。
10、crispr/cas系统是一种快速、有效的基因编辑系统，其中crispr/cas9是应用最广泛的crispr/cas系统之一，其能够高效、精确地对dna序列进行修饰、替换和插入。crispr/cas9系统进行基因编辑的机制包括：与特定靶序列(原间隔序列)同源的crispr阵列被转录为许多前crispr rna(pre-crrna)，这些pre-crrna与更小的反式激活crrna(tracrrna)通过碱基配对形成复合物。这种复合物可以与cas9蛋白结合，导致较长的pre-crrna被rna酶iii切割，分离成单独的crrna/tracrrna复合物。当crrna/tracrrna将cas9复合物引导至目标序列时，crrna结合原间隔序列相邻基序(pam)后的目标序列，靶序列解旋，并被cas9蛋白的核酸酶结本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种靶向CD7的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含CDR1、CDR2和CDR3；
2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含与SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的任一氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的任一氨基酸序列。
4.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包含如权利要求1-3中任一项所述的靶向CD7的单域抗体。
5.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包含
6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述跨膜结构域来源于CD8α、CD28、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、TCRα
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述跨膜结构域来源于CD8α。
8.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述细胞内信号传导结构域来源于FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d或它们的任何组合。
9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ。
10.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述细胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号结构域，其中所述共刺激信号结构域来源于TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD134(OX40)、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、ICAM、4-1BB(CD137)、CD276(B7-H3)、CD278(ICOS)、GITR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、BTLA、CD8α、LFA-1、NKG2C、LAT、SLP-76、DAP10、PD-1、TRIM、ZAP70配体或它们的任何组合。
11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述共刺激信号结构域来源于4-1BB(CD137)。
12.根据权利要求5-10中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包含位于细胞外抗原结合结构域C端和跨膜结构域N端之间的铰链区。
13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述铰链区来源于CD8α、CD28、CD137、IgG4、IgG1或它们的任何组合。
14.根据权利要求5-13中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包含位于嵌合抗原受体多肽N端的信号肽。
15.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述信号肽来源于HLA-A、CD8α、CD4、CD33、CD137、GM-CSFRα、IgG1、Igκ、IL-2或它们的任何组合。
16.一种嵌合抗原受体，其特征在于，其包含与SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:20所示的任一氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
17.一种嵌合抗原受体，其特征在于，其包含如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19或SEQ IDNO:20所示的任一氨基酸序列。
18.一种分离的核酸，其特征在于，包含编码如权利要求4-17中任一项所述的嵌合抗原受体的核酸序列。
19.根据权利要求18所述的分离的核酸，其特征在于，包含如SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22或SEQ ID NO:23所示的任一核酸序列。
20.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求18或19所述的分离的核酸。
21.一种工程化的免疫效应细胞，其特征在于，包含如权利要求4-17中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求18或19所述的分离的核酸、或权利要求20所述的载体。
22.根据权利要求21所述的工程化的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、NKT...
【技术特征摘要】
1.一种靶向cd7的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含cdr1、cdr2和cdr3；
2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含与seq id no:10、seq id no:11或seq id no:12所示的任一氨基酸序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体包含如seq id no:10、seq id no:11或seq id no:12所示的任一氨基酸序列。
4.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包含如权利要求1-3中任一项所述的靶向cd7的单域抗体。
5.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包含
6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述跨膜结构域来源于cd8α、cd28、cd3ζ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd4、cd5、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd45、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd152、cd154、tcrα、tcrβ、tcrγ、tcrδ、tcrζ、ox40、icos、lag-3、2b4、btla、ctla-4、pd-1或它们的任何组合。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述跨膜结构域来源于cd8α。
8.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述细胞内信号传导结构域来源于fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd3ζ、cd22、cd79a、cd79b、cd66d或它们的任何组合。
9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述细胞内信号传导结构域来源于cd3ζ。
10.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述细胞内信号传导结构域进一步包含共刺激信号结构域，其中所述共刺激信号结构域来源于tlr1、tlr2、tlr3、tlr4、tlr5、tlr6、tlr7、tlr8、tlr9、tlr10、card11、cd134(ox40)、cd2、cd7、cd27、cd28、cd30、cd40、cd83、icam、4-1bb(cd137)、cd276(b7-h3)、cd278(icos)、gitr、light、hvem(lightr)、btla、cd8α、lfa-1、nkg2c、lat、slp-76、dap10、pd-1、trim、zap70配体或它们的任何组合。
11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，其中所述共刺激信号结构域来源于4-1bb(cd137)。
12.根据权利要求5-10中任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，进一步包含位于细胞外抗原结合结构域c端和跨膜结构域n端之间的铰链区。
13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其特征在...
【专利技术属性】
技术研发人员：周丹，何雨辰，孙海，汪远进，黄智威，李红梅，
申请(专利权)人：成都优赛诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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