【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及一种非特异过氧化酶的组合表达系统及其应用。
技术介绍
1、2004年，人们在茶树菇cyclocybeaegerita(以前称为agrocybeaegerita)中发现了非特异性过氧化物酶(upo，e.c.1.11.2.1)，这是一种具有单(过)氧酶活性的新型血红素硫酸盐过氧化物酶。迄今为止，已报道的非特异过氧化酶底物超过300种，而且数量还在不断增加。值得注意的是，在特定氧化有机分子中的非活化c-h键时，非特异过氧化酶和细胞色素p450酶具有相似的性质。细胞色素p450酶不仅能催化单氧合反应，还能进行脱烷基、s-氧化、n-氧化、醇和醛氧化以及脱卤和脱氮。然而，由于分离制备的不稳定性和复杂性，细胞色素p450酶的商业应用仍局限于全细胞氧化程序。相比之下，非特异过氧化酶是一种相对稳定的细胞外酶，具有活性高，不需要昂贵或复杂的氧化还原伙伴等优势。此外，非特异过氧化酶以自给自足的方式运行，由适量的过氧化氢"驱动"。过氧化氢既是主要的电子受体，也是氧的来源。因此，非特异过氧化酶被认为是一种自给自足的过氧酶。
2、目前非特异过氧化酶表达量不高，为了提高非特异过氧化酶的生产效率，酵母宿主成为了研究的重点。毕赤酵母komagataellaphaffii(原名pichiapastoris)拥有高效的异源表达系统，培养条件简单，适合高密度发酵。因此，毕赤酵母已被广泛用于生产重组蛋白质。据报道，有多种策略可提高异源蛋白在毕赤酵母中的高效分泌表达，但大多数文献都侧重于单因素或双因素优化，这对异源蛋白分泌水平的
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的不足，提供一种非特异过氧化酶的组合表达系统，并将其应用于生产非特异过氧化酶中，以克服现有技术中非特异过氧化酶表达产量不理想的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：
3、第一方面，本专利技术提供了一种非特异过氧化酶的组合表达系统，包括宿主细胞和转化入所述宿主细胞的表达载体，所述表达载体包括插入有编码非特异过氧化酶蛋白upo的基因的第一表达载体和插入有编码二硫键异构酶pdi的基因的第二表达载体，所述宿主细胞为毕赤酵母(komagataellaphaffii)gs115。
4、本专利技术构建二硫键异构酶与非特异过氧化酶共表达的组合表达系统，使得非特异过氧化酶的表达量显著提高，由于二硫键异构酶在宿主胞内表达，而非特异过氧化酶能够分泌表达到宿主细胞外，所以培养基上清中非特异过氧化酶浓度增加的同时不会新产生其他蛋白。最终在5升生物反应器中非特异过氧化酶蛋白浓度可以达到333.3mg/l。
5、二硫键异构酶是硫氧化还原酶家族中的一员，其主要功能是在内质网上催化新和成的蛋白形成正确的二硫键。错误折叠的蛋白累计到一定程度就会引起细胞内质网应激反应，进而造成细胞代谢负担。非特异过氧化酶中含有一对二硫键，更多的二硫键异构酶可以帮助形成正确的二硫键，进而提高表达量。本专利技术中的宿主细胞为毕赤酵母(komagataellaphaffii)gs115，毕赤酵母自身分泌的杂蛋白很少，因此高分泌的外源蛋白易从培养基中分离；此外与酿酒酵母相比，毕赤酵母糖基化程度更低，所生产的非特异过氧化酶更接近天然蛋白。
6、作为优选，所述编码非特异过氧化酶蛋白upo的基因来自于茶树菇(cyclocybeaegerita)tm-a1菌。
7、作为优选，所述编码非特异过氧化酶蛋白upo的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8、作为优选，所述编码二硫键异构酶蛋白pdi的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9、作为优选，所述第一表达载体的原始载体为ppic系列载体，所述第二表达载体的原始载体为ppic系列载体。
10、作为优选，所述第一表达载体的原始载体为载体ppiczαa。
11、作为优选，所述第二表达载体的原始载体为载体ppic3.5k。
12、作为优选，其构建方法包括以下步骤：
13、(1)合成密码子优化的编码非特异过氧化酶upo的基因；
14、(2)将所述步骤(1)中得到的编码非特异过氧化酶upo的基因插入至载体ppiczαa中，构建第一表达载体ppiczαa-upo；
15、(3)将所述步骤(2)中得到的第一表达载体ppiczαa-upo线性化后电导入毕赤酵母(komagataellaphaffii)gs115，得到工程菌株；
16、(4)将编码二硫键异构酶pdi的基因插入至载体ppic3.5k中，构建第二表达载体ppic3.5k-pdi；
17、(5)将所述步骤(4)中得到的第二表达载体ppic3.5k-pdi线性化后电导入所述步骤(3)中得到的工程菌株中，从而得到所述非特异过氧化酶的组合表达系统。
18、进一步优选，所述编码非特异过氧化酶upo的基因插入至载体ppiczαa中启动子和信号肽下游，所述编码二硫键异构酶pdi的基因插入至载体ppic3.5k中启动子的下游。
19、构建的第一表达载体在启动子下游含有信号肽，第二表达载体在启动子下游无信号肽。因此，非特异过氧化酶蛋白分泌到细胞外，而二硫键异构酶蛋白存留在细胞内。
20、所述第一表达载体中，编码非特异过氧化酶upo的基因的上游序列加有xhoⅰ酶切位点，下游加有notⅰ酶切位点；首先用线性化酶bspeⅰ切载体ppiczαa，然后与upo基因连接，从而构建第一表达载体ppiczαa-upo。
21、所述第二表达载体中，首先用xhoⅰ酶和notⅰ酶切载体ppic3.5k，然后与pdi基因连接，从而构建第二表达载体ppic3.5k-pdi。
22、作为优选，所述编码非特异过氧化酶upo的基因和编码二硫键异构酶pdi的基因过表达。
23、进一步优选，所述第一表达载体ppiczαa-upo的拷贝数为2～3个，所述第二表达载体ppic3.5k-pdi的拷贝数至少为2个。
24、本专利技术中所涉及到的毕赤酵母gs115，质粒ppiczαa，质粒ppic3.5k均为商业化产品，购自invitrogen corp.san diego.california.usa。
25、第二方面，本专利技术提供了所述的非特异过氧化酶的组合表达系统在生产非特异过氧化酶中的应用。
26、采用bsm培养基进行分批补料培养，全程分为分批培养阶段和补料培养阶段，分批培养阶段所用碳源为甘油，其目的用于菌体累积；补料培养阶段所用碳源为甲醇，其目的用于蛋白表达。整个培养基段要求溶氧量(do)>25％。
27、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
28、(1)本专利技术将宿主细胞选择为毕赤酵母，其自身分泌的杂蛋白很少，因此高分泌的外源蛋白——非特异过氧化酶易从培养基中分离，且毕赤酵母糖基化程度更低，所生本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种非特异过氧化酶的组合表达系统，包括宿主细胞和转化入所述宿主细胞的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括插入有编码非特异过氧化酶蛋白UPO的基因的第一表达载体和插入有编码二硫键异构酶PDI的基因的第二表达载体，所述宿主细胞为毕赤酵母(Komagataellaphaffii)GS115。
2.如权利要求1所述的非特异过氧化酶的组合表达系统，其特征在于，所述编码非特异过氧化酶蛋白UPO的基因来自于茶树菇(Cyclocybe aegerita)TM-A1菌。
3.如权利要求1或2所述的非特异过氧化酶的组合表达系统，其特征在于，所述编码非特异过氧化酶蛋白UPO的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如权利要求1所述的非特异过氧化酶的组合表达系统，其特征在于，所述编码二硫键异构酶蛋白PDI的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求1所述的非特异过氧化酶的组合表达系统，其特征在于，所述第一表达载体的原始载体为pPIC系列载体，所述第二表达载体的原始载体为pPIC系列载体。
6.如权利要求5所
7.如权利要求5或6所述的非特异过氧化酶的组合表达系统，其特征在于，所述第二表达载体的原始载体为载体pPIC3.5K。
8.如权利要求1所述的非特异过氧化酶的组合表达系统，其特征在于，其构建方法包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的非特异过氧化酶的组合表达系统，其特征在于，所述编码非特异过氧化酶UPO的基因和编码二硫键异构酶PDI的基因过表达。
10.权利要求1～9中任意一项所述的非特异过氧化酶的组合表达系统在生产非特异过氧化酶中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种非特异过氧化酶的组合表达系统，包括宿主细胞和转化入所述宿主细胞的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括插入有编码非特异过氧化酶蛋白upo的基因的第一表达载体和插入有编码二硫键异构酶pdi的基因的第二表达载体，所述宿主细胞为毕赤酵母(komagataellaphaffii)gs115。
2.如权利要求1所述的非特异过氧化酶的组合表达系统，其特征在于，所述编码非特异过氧化酶蛋白upo的基因来自于茶树菇(cyclocybe aegerita)tm-a1菌。
3.如权利要求1或2所述的非特异过氧化酶的组合表达系统，其特征在于，所述编码非特异过氧化酶蛋白upo的基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
4.如权利要求1所述的非特异过氧化酶的组合表达系统，其特征在于，所述编码二硫键异构酶蛋白pdi的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，赵理想，沈其，邹树平，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：
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