【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产动物遗传育种，具体涉及一种基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法。
技术介绍
1、大黄鱼是我国人工养殖产量最高的海水鱼类(数据来源于2022年中国统计年鉴)，素有“国鱼”美誉。然而，种质退化、病害频发及良种缺乏等问题严重制约了大黄鱼产业的可持续发展(wang et al.,2012,loss ofgenetic diversity in the cultured stocksofthe large yellow croaker,larimichthys crocea,revealedbymicrosatellites,intj mol sci,13(5):5584-5597)。因此，迫切需要创制高抗优质的大黄鱼新种质、培育适宜不同养殖模式的大黄鱼新品种。基于crispr/cas9的基因组编辑技术可以定点地向基因组引入有利变异，具有操作简单、成本低廉及高效等优点。基因编辑大致过程为：利用显微注射技术向受精卵或胚胎中引入sgrna和cas9核酸内切酶，cas9核酸内切酶可以在grna的引导下，对靶基因进行定点切割，断裂的dsrna在机体修复系统的作用下产生各种突变。基因组编辑已广泛应用于鱼类特别是淡水鱼类的遗传育种实践中。基因组编辑已广泛应用于水产动物特别是淡水鱼如鲤、银鲫及斑点叉尾鮰等遗传育种实践中(remi et al,2019,potential of genome editing to improve aquaculture breeding and production,trends genet,3
2、由于大多数的海水鱼卵壳坚硬及人工受精难以获得高质量受精卵等问题基因组编辑技术仅在少数的海水鱼类中获得了成功。目前海水鱼主要通过两种方式开展显微注射：1.制作特殊显微注射针来完成显微注射操作，如褐牙鲆(kim et al.,2019,crispr/cas9-mediated myostatin disruption enhances muscle mass in the oliveflounderparalichthys olivaceus,aquaculture,512:734336)。然而，这种显微注射针的制作需要特殊的设备、操作复杂且耗时(goto.,et al,2019,microinjection ofmarinefish eggs,methods mol biol,1874:475-487)。2.在海水鱼受精卵未硬化的窗口期内完成显微注射。海水鱼卵子受精后3-5min内存在一个未硬化窗口期，在窗口期内开展显微注射。如专利申请团队前期建立的大黄鱼基因组编辑技术(li et al.,2023,effective crispr/cas9-based genome editing in large yellow croaker(larimichthys crocea),aquac.fish,1(1):26-32)。这种方法依赖体外人工受精。然而，由于人工催产大黄鱼个体间的卵巢发育及同一个体不同卵子发育极其不同步，人工受精往往很难获得高质量的受精卵，这导致大黄鱼人工受精的受精卵孵化率远不如自然受精的，进而严重影响基因编辑f0代的存活率和基因编辑效率。不同于人工挤出的卵子，大黄鱼自然排出的卵子均已发育成熟(即ⅴ期)，自然受精的受精卵成活率远远高于人工受精的存活率。而且，自然受精的受精卵还具有量大、易于获取等优点，建立可以直接利用自然受精的受精卵开展基因组编辑将会提供海水鱼基因编辑存活率和基因编辑效率，并为海水鱼基因的功能研究和遗传改良提供了新的技术手段。
技术实现思路
1、为了克服现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种简单、高效且可以直接利用自然受精获得的受精卵开展基因组编辑的新方法。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：
3、一种基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，包括：
4、1)获取自然受精的大黄鱼受精卵；
5、2)使用链霉蛋白酶消化受精卵卵壳；
6、3)利用显微注射技术将含cas9蛋白、sgrna及酚红的混合液注射到大黄鱼受精卵动物极。
7、进一步的，步骤1)中用于基因组编辑的受精卵为自然受精五分钟内的大黄鱼受精卵。
8、进一步的，步骤2)具体为：在水温24℃条件下，利用5mg/ml的链霉蛋白酶消化受精卵30min，以使受精卵卵壳软化。
9、进一步的，步骤3)显微注射的混合液中cas9蛋白终浓度为15um，sgrna浓度为500ng/ul，注射量为1nl。
10、进一步的，步骤3)中靶基因sgrna序列为：
11、5'-mg*ma*mg*ugaagaagauaacacacguuuuagagcuagaa auagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaagu ggcac cgagucggugcu*mu*mu*mu-3'；m和*分别表示2-氧甲基和硫代修饰，其中修饰的目的是为了增加序列稳定性。
12、进一步的，基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，还包括：4)检测突变类型，计算基因组编辑效率。
13、进一步的，步骤4)中所述突变检测方法为靶片段的pcr扩增及pcr产物测序；
14、pcr扩增所用的引物为：gr2_f:tgtggttgctatgcactcgt；gr2_r:atgaacgggctggatggaag。
15、相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
16、本专利技术提供的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法无需借助特殊设备制作显微注射针；相比以往使用人工受精的受精卵，本专利技术使用了自然受精的受精卵，大大提高了显微注射后f0的存活率和基因组编辑效率。
17、本专利技术可以用于大黄鱼基因功能研究和大黄鱼遗传改良，并为其他海水鱼的基因组编辑育种提供借鉴。
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1.一种基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，步骤1)中用于基因组编辑的受精卵为自然受精5分钟内的大黄鱼受精卵。
3.根据权利要求1所述的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，步骤2)具体为：在水温24℃条件下，利用5mg/ml的链霉蛋白酶消化受精卵30min，以使受精卵卵壳软化。
4.根据权利要求1所述的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，步骤3)显微注射的混合液中Cas9蛋白终浓度为15uM，sgRNA浓度为500ng/uL，注射量为1nL。
5.根据权利要求4所述的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，步骤3)中酚红添加量为0.1wt％。
6.根据权利要求1所述的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，步骤3)中靶基因sgRNA序列为：5'-mG*mA*mG*UGAAGAAGAUAACACACGUUUUAGAGCUAGAAAUA
7.根据权利要求1所述的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，还包括：4)检测突变类型，计算基因组编辑效率。
8.根据权利要求6所述的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，步骤4)中所述突变检测方法为靶片段的PCR扩增及PCR产物测序；
...【技术特征摘要】
1.一种基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，包括：
2.根据权利要求1所述的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，步骤1)中用于基因组编辑的受精卵为自然受精5分钟内的大黄鱼受精卵。
3.根据权利要求1所述的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，步骤2)具体为：在水温24℃条件下，利用5mg/ml的链霉蛋白酶消化受精卵30min，以使受精卵卵壳软化。
4.根据权利要求1所述的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其特征在于，步骤3)显微注射的混合液中cas9蛋白终浓度为15um，sgrna浓度为500ng/ul，注射量为1nl。
5.根据权利要求4所述的基于受精卵卵壳软化的大黄鱼高效基因组编辑方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈新华，邵光明，崔雪凡，石源，黎球华，段雅如，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：
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