【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及猫疱疹病毒检测，尤其涉及一种检测猫疱疹病毒的era引物探针组合物及应用。
技术介绍
1、猫疱疹病毒(feline herpesvirus)是具有包膜的双链dna病毒，在细胞核内进行增殖，并形成核内包涵体。猫疱疹病毒经由口鼻、结膜等途径进入猫体内，从而引发猫鼻黏膜上皮细胞的感染，并借此传播至咽喉、结膜、气管、支气管及小支气管，病灶为局部多发性坏死性及发炎性病灶，特别是新生儿或低体温的幼猫。猫疱疹病毒可以导致猫的病毒性鼻气管炎(fvr)和一些眼部的问题，常常会造成黏膜表面的糜烂及溃疡、鼻炎及结膜炎，偶尔也会出现被认为具有诊断特异性的角膜树突状溃疡病灶，典型的症状包括有发烧、沉郁、厌食、浆液样或浆液血色漾眼睛及鼻分泌物、结膜充血、打喷嚏及较少见的流涎及咳嗽，常见继发性的细菌感染，分泌物就会呈现脓样，容易罹患猫疱疹病毒的幼猫也可能造成原发性肺炎及病毒血症，继而引发全身性症状及死亡。猫疱疹病毒在猫中具有很强的传染性，它是猫中最常见的传染病原体之一。
2、猫疱疹病毒一般采用pcr方法来检测，病毒分离是检测猫疱疹病毒感染最准确的检验方式，但较耗时，也可用血清中和试验或酶免疫标定法(elisa)来检测血清、眼房水及脑脊髓液中的猫疱疹病毒抗体，但因为自然感染及疫苗接种的原因，猫疱疹病毒抗体血清阳性率是较高的。现有技术中缺乏对病毒进行快速、准确、敏感的检测方法。目前针对猫疱疹病毒检测的试剂盒大多存在操作复杂、特异性差、灵敏度低及检测结果准确性不高等缺陷。
技术实现思路
1、本
2、为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：
3、本专利技术提供了一种era引物探针组合物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如seq id no1、seq id no2所示；所述探针的核苷酸序列如seq id no3所示。
4、优选的，所述探针的5’端第30碱基处标记有fam荧光报告基团，所述探针的3’端第16碱基处标记有bhq1荧光淬灭基团，所述探针荧光报告基团和荧光淬灭基团间的1个碱基替换为四氢呋喃，所述探针的3’端标记有c3 spacer基团。
5、本专利技术还提供了上述的era引物探针组合物在检测猫疱疹病毒试剂盒中的应用。
6、本专利技术还提供了一种检测猫疱疹病毒的试剂盒，所述试剂盒包含上述的era引物探针组合物。
7、优选的，所述试剂盒还包含但不限于包含冻干粉、缓冲液和激活剂。
8、优选的，所述冻干粉由克列诺酶5u、核酸外切酶ⅲ25u、dna单链结合蛋白20μg、腺嘌呤核苷三磷酸50μg、肌酸激酶1μg和脱氧核苷酸4μg组成；
9、所述缓冲液为水、三羟甲基氨基甲烷、乙酸、乙酸钾、二硫苏糖醇、聚乙二醇8000或磷酸肌酸；所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为250mm，乙酸的浓度为3～30mm，乙酸钾的浓度为125mm，乙酸钾的浓度为125mm，二硫苏糖醇的浓度为2mm，聚乙二醇8000的浓度为2％，磷酸肌酸的浓度为50mm；
10、所述激活剂为乙酸镁溶液，乙酸镁溶液的浓度为125mm。
11、本专利技术还提供了一种利用era引物探针组合物进行检测猫疱疹病毒的方法，包含以下步骤：
12、步骤1)提取猫样本中病毒核酸，得样本核酸；
13、步骤2)将样本核酸、上述的era引物探针组合物、水和缓冲液加入到含有冻干粉的pcr反应管中，振荡后短促离心，再在管帽处加入激活剂，盖上管帽，振荡后短促离心；
14、步骤3)将pcr反应管放入恒温检测仪中进行酶促重组等温扩增，每隔30秒检测一次fam荧光信号，所述猫疱疹病毒核酸阴、阳性可通过fam通道检测出。
15、优选的，所述样本核酸为10μl、权利要求1或2所述的era引物探针组合物为5μl、水为13μl、缓冲液为20μl、激活剂为2μl、冻干粉为0.1mg。
16、优选的，所述酶促重组等温扩增的反应程序为40℃，反应20min。
17、本专利技术的主要原理是：在酶促重组等温扩增中，包含有一对扩增引物和一条多重修饰荧光探针。引物与样本dna特异性结合，探针结合区域在引物对之间。检测反应开始进行时，引物与样本特异性结合，在克列诺酶的作用下进行扩增，扩增出的dna片段在dna单链结合蛋白作用下维持单链状态。多重修饰荧光探针与dna片段特异性结合前，荧光报告基团与荧光淬灭基团相邻，荧光信号会被荧光淬灭基团吸收，仪器无法检测到荧光信号；探针与dna片段特异性结合后，核酸外切酶ⅲ会识别并裂解双链中探针上的四氢呋喃，荧光淬灭基团会脱离荧光报告基团，仪器能够检测到荧光信号。在恒温状态下，痕量靶dna特异性区域扩增数亿倍，仪器可检测到显著的荧光信号。
18、与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
19、本专利技术通过提供一种era引物探针组合物，并将其应用于检测猫疱疹病毒中，可以不需要昂贵的全自动荧光pcr仪，利用恒温设备即可简单且快速地检测猫疱疹病毒，操作简单、检测耗时少，不需要复杂昂贵的设备和实验室。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种ERA引物探针组合物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID No1、SEQID No2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID No3所示。
2.根据权利要求1所述的ERA引物探针组合物，其特征在于，所述探针的5’端第30碱基处标记有FAM荧光报告基团，所述探针的3’端第16碱基处标记有BHQ1荧光淬灭基团，所述探针荧光报告基团和荧光淬灭基团间的1个碱基替换为四氢呋喃，所述探针的3’端标记有C3Spacer基团。
3.权利要求1或2所述的ERA引物探针组合物在检测猫疱疹病毒试剂盒中的应用。
4.一种检测猫疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的ERA引物探针组合物。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含但不限于包含冻干粉、缓冲液和激活剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述冻干粉由克列诺酶5U、核酸外切酶Ⅲ25U、DNA单链结合蛋白20μg、腺嘌呤核苷三磷酸50μg、肌酸激酶1μg和脱氧核苷酸4μg组成；
7.一种利用ERA引物探
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述样本核酸为10μL、权利要求1或2所述的ERA引物探针组合物为5μL、水为13μL、缓冲液为20μL、激活剂为2μL、冻干粉为0.1mg。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述酶促重组等温扩增的反应程序为40℃，反应20min。
...【技术特征摘要】
1.一种era引物探针组合物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如seq id no1、seqid no2所示；所述探针的核苷酸序列如seq id no3所示。
2.根据权利要求1所述的era引物探针组合物，其特征在于，所述探针的5’端第30碱基处标记有fam荧光报告基团，所述探针的3’端第16碱基处标记有bhq1荧光淬灭基团，所述探针荧光报告基团和荧光淬灭基团间的1个碱基替换为四氢呋喃，所述探针的3’端标记有c3spacer基团。
3.权利要求1或2所述的era引物探针组合物在检测猫疱疹病毒试剂盒中的应用。
4.一种检测猫疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1或2所述的era引物探针组合物。
5.根据权利要求4所...
【专利技术属性】
技术研发人员：张陆明，张勇，黄健，
申请(专利权)人：江苏普若维生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。