【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物，尤其是一种提高n-乙酰氨基葡萄糖转化率及产量的方法、菌株及应用。
技术介绍
1、n-乙酰氨基葡萄糖(n-acetylglucosamine，glcnac)是一种重要的功能性单糖。glcnac广泛应用于食品保健领域、化妆品工业领域、生物医药领域等。研究表明，glcnac在临床上可用于缓解炎症性关节疾病，促进软骨损伤的愈合，改善肠道消化吸收功能，促进生长，还可以调节胎儿心脏的生长发育。glcnac具有广泛的医药学应用前景，引起了国内外研究者的广泛关注，成为研究的热点。
2、目前glcnac的主要生产方法有化学法、酶法和微生物发酵法。其中，化学法由于其剧烈的反应条件、严重的环境污染以及有限的生产原料具有很大的局限性。酶法则受限于高昂的生产成本以及较长的生产周期，很难实现工业化大规模的生产。与前两种方法相比，微生物发酵法生产glcnac具有发酵周期短、生产成本低、环境污染小等诸多优势，受到了研究人员的广泛关注。因此，微生物发酵法成为目前glcnac工业生产的主流。
3、专利公开文献cn112877272a公开了一种n-乙酰氨基葡萄糖的大肠杆菌工程菌及发酵生产方法，本专利技术通过阻断糖酵解途径和磷酸戊糖途径对n-乙酰氨基葡萄糖合成前体果糖-6-磷酸的分流，提高了大肠杆菌底盘细胞中的产物前体供应，再利用游离的高拷贝质粒在底盘细胞内表达了n-乙酰氨基葡萄糖合成途径的关键酶，利用混合碳源培养基发酵生产n-乙酰氨基葡萄糖，提高了n-乙酰氨基葡萄糖的产量。但是大肠杆菌在发酵过程中会分泌内毒素，导致生产的
4、专利公开文献cn104195094a公开了一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。通过在枯草芽孢杆菌中进行基因操作，构建了从葡萄糖到n-乙酰氨基葡萄糖的代谢通路，增强了n-乙酰氨基葡萄糖合成途径中的限速酶基因表达，同时，也敲除了导致n-乙酰氨基葡萄糖消耗和回流的基因，积累了更高浓度的n-乙酰氨基葡萄糖，具有较高的工业化利用价值。但是该枯草芽孢杆菌重组菌株尚未对n-乙酰氨基葡萄糖转化率进行研究。
5、通过对比，本专利技术专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种提高n-乙酰氨基葡萄糖转化率及产量的方法、菌株及应用。
2、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种提高n-乙酰氨基葡萄糖转化率及产量的菌株，所述载体的构建方法包括以下步骤：
4、(1)异源表达glcnac-6p合成酶编码基因gna1
5、在amye位点，插入pc2up启动子控制的glcnac-6p合成酶编码基因gna1；
6、(2)敲除
7、利用crispr-cas9技术，无痕敲除glcnac特异性转运蛋白基因nagp、glcnac-6p脱乙酰酶基因naga、glcn-6p脱氨酶基因nagbb；所述编码基因nagp的基因序列为seq idno.4，naga的基因序列为seq id no.5,nagbb的基因序列为seq id no.6；
8、(3)引入
9、1)异源表达磷酸解酮酶编码基因fxpk
10、在murq位点，插入pc2up启动子控制的磷酸解酮酶编码基因fxpk；
11、2)利用分子开关抑制磷酸果糖激酶编码基因pfka
12、在pfka基因位点插入xylo序列，并引入pgrac启动子控制的xylr蛋白，pfka的基因序列为seq id no.9，xylo位点的基因序列为seq id no.10，xylr片段的基因序列为seq idno.11。
13、进一步地，所述步骤(1)中gna1来源于酿酒酵母，gna1片段的基因序列为seq idno.1，pc2up启动子的基因序列为seq id no.2，amye的基因序列为seq id no.3。
14、进一步地，所述步骤(3)中murq的基因序列为seq id no.7，所述fxpk来源于青春双歧杆菌，fxpk片段基因序列为seq id no.8，pc2up启动子的基因序列为seq id no.2。
15、一种利用如上所述的菌株的n-乙酰氨基葡萄糖合成菌株，所述合成菌株是将载体pht01-xylr转入所述载体中，弱化磷酸果糖激酶基因pfka，获得n-乙酰氨基葡萄糖合成菌株。
16、如上所述的菌株在发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖中的应用。
17、一种利用如上所述的菌株发酵制备n-乙酰氨基葡萄糖的方法，包括如下步骤：
18、摇瓶发酵：从-80℃冰箱取出发酵菌株，在lb固体平板上划线，37℃培养箱培养12h；挑取长出的单菌落接种到装有4ml lb液体培养基中，37℃，转速200rpm，培养12h；将菌液以1-3％接种量，接种到装有20ml lb液体培养基中，37℃，转速150-300rpm，培养12h；再将种子液以2-8％的接种量，接种到装有75ml发酵培养基中，37℃，转速150-300rpm，发酵24-48h，即得glcnac。
19、进一步地，所述lb固体培养基为：10.0g/l胰蛋白胨、5.0g/l酵母浸出物、10.0g/lnacl、15％琼脂粉。
20、进一步地，所述发酵培养基为：50-70g/l葡萄糖、2-4g/lkh2po4、10-12g/l酵母提取物、5-8g/l胰蛋白陈、5-8g/l(nh4)2so4、10-13g/lk2hpo4·3h2o和8-10ml/l微量金属溶液；
21、其中，微量金属溶液成分包括：3-6g/lfeso4·7h2o、0.1-0.3g/l cucl2·h2o、3-6g/l cacl2、1-3g/lmnso4·5h2o、0.1-0.3g/lalcl3·6h2o、0.3-0.5g/l cocl2·6h2o、0.03-0.05g/l h3bo4、0.1-0.4g/lna2moo4·2h2o、0.1-0.4g/l znso4·7h2o。
22、本专利技术取得的优点和积极效果为：
23、1、本专利技术利用crispr-cas9基因编辑技术，获得生产n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)的枯草芽孢杆菌基因工程菌株。构建分子开关控制磷酸果糖激酶基因pfka的表达，摇瓶发酵产量达到10.367g/l。
24、2、本专利技术在食品安全级菌株枯草芽孢杆菌中进行改造使其生产glcnac，进行基因工程改造修饰，减少碳通量的代谢损失，葡萄糖到glcnac转化率由7.12％提高到了24.43％。
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1.一种提高N-乙酰氨基葡萄糖转化率及产量的菌株，其特征在于：所述菌株的构建方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：所述步骤(1)中GNA1来源于酿酒酵母，GNA1片段的基因序列为SEQ ID NO.1，PC2up启动子的基因序列为SEQ ID NO.2，amyE的基因序列为SEQ ID NO.3。
3.根据权利要求1所述的菌株，其特征在于：所述步骤(3)中murQ的基因序列为SEQ IDNO.7，所述fxpk来源于青春双歧杆菌，fxpk片段基因序列为SEQ ID NO.8，PC2up启动子的基因序列为SEQ ID NO.2。
4.一种利用如权利要求1至3任一项所述的菌株的N-乙酰氨基葡萄糖合成菌株，其特征在于：所述合成菌株是将载体pHT01-xylR转入所述载体中，弱化磷酸果糖激酶基因pfkA，获得N-乙酰氨基葡萄糖合成菌株。
5.如权利要求4所述的菌株在发酵制备N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。
6.一种利用如权利要求4所述的菌株发酵制备N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于：包括如下步骤：
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