【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于药物靶标鉴定领域，具体涉及一种天然药物分子槲皮素的靶标及其鉴定方法和应用。
技术介绍
1、槲皮素（quercetin，结构式如式ⅰ所示）是一种黄酮类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗衰老等多种生物活性，广泛存在于人们的日常饮食中。它作为抗sars-cov-2的潜在药物用于临床试验，它与达沙替尼组合也被认为是最具临床试验前景的9种抗衰药物之一。然而，槲皮素发挥生物活性的作用机制尚不明确，直接互作靶标鲜有报道，靶标的鉴定和确证对于开发基于槲皮素结构的抗衰等药物，以及基于槲皮素靶标的药物研究都有重要意义。
2、糖原合成酶激酶3（gsk-3）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是糖原代谢途径中的一种重要激酶，它有两种异构体gsk-3α和gsk-3β。既往研究探索了gsk-3在细胞功能方面的作用，以及在与年龄相关疾病（如胰岛素抵抗、全身炎症和阿尔兹海默症）中所发挥的作用，提出其可能成为抗衰老相关疾病的潜在靶点。其中，有研究表明：gsk-3α敲除鼠表现出寿命缩短和年龄相关病理增加的表型，gsk-3α具有抗衰潜质，但尚无靶向gsk-3α的抗衰药物，也无直接证据证明其与抗衰药物之间存在相互作用。
3、人的羰基还原酶1（cbr1）属于短链脱氢酶/还原酶家族，是还原型辅酶（nadph）依赖性氧化还原酶，广泛在肝脏中表达。cbr1可以还原外源芳香醛、酮等羰基类物质，起到解毒功能。cbr1在保护细胞免受氧化应激导致的细胞损伤中发挥着重要作用。研究表明：局部淋巴结转移（lnm）的头颈鳞状细胞癌（hnscc）组织中cbr1
4、丝裂原活化蛋白酶1（mapk1），是map激酶家族成员，又称为细胞外信号调节激酶（erk2），它参与调控细胞的生长、分化、凋亡和应激。它被上游激酶磷酸化后，异位至核内，调节靶基因的表达，是细胞外刺激与细胞内信号的关键连接分子。研究表明，erk2是脑炎症病理相关信号级联的上游关键分子，靶向erk2的药物治疗有改善炎症的潜力；erk2在肿瘤的生长和增值、侵蚀、转移中其重要作用。erk2是创新药靶向的热门靶标，但目前尚未有靶向erk2的抑制剂上市。
5、从drugbank公共数据库中，目前检索到槲皮素有29种已经报道的潜在靶标，cbr1位列其中，但gsk3a与mapk1尚未报道。
技术实现思路
1、针对上述存在的问题，本专利技术确立了gsk3a、cbr1和mapk1是与槲皮素直接互作的新靶标，提供了鉴定其直接靶标的方法。槲皮素的这些靶标具有药物靶向治疗的潜质，具体可应用于槲皮素及其衍生药物的抗衰、抗炎治疗。
2、为了实现以上目的，本专利技术提供的天然药物分子槲皮素的靶标所采取的技术方案为：
3、一种天然药物分子槲皮素的靶标，所述靶标为gsk3a、cbr1和mapk1中至少一种。
4、为了实现以上目的，本专利技术提供的天然药物分子槲皮素靶标的鉴定方法所采取的技术方案为：
5、一种天然药物分子槲皮素靶标的鉴定方法，包括以下步骤：
6、（1）在细胞培养箱中培养细胞，加入槲皮素或dmso与细胞共孵育后，用缓冲液清洗，并将细胞悬液分装，对细胞悬液加热，然后破裂细胞，将可溶蛋白和细胞碎片及不可溶蛋白沉淀分离；
7、（2）取可溶上清，加入丙酮沉淀蛋白，离心，向沉淀蛋白中加入100 mm碳酸氢铵进行重悬，利用bca蛋白浓度测定法检测蛋白浓度；
8、（3）加入dtt进行还原反应，再加入iaa，室温避光反应，加入胰酶，进行酶切反应，再加入酸终止反应；
9、（4）c18小柱对肽段脱盐，洗脱液浓缩干后，重悬，测定肽段浓度，等质量肽段1 μg用于质谱上机；
10、（5）采集的.raw质谱文件做蛋白鉴定。
11、优选地，步骤（1）中，在37℃、5% co2的细胞培养箱中培养细胞至80%汇合度，加入浓度为100μm槲皮素与细胞共孵育，弃去培养基，加入 pbs缓冲液，收集细胞悬液至离心管，加入pbs清洗皿合并细胞悬液，离心，弃上清，向细胞沉淀中加入pbs，混匀后，使用液氮反复冻融破裂细胞，提取蛋白，通过高速离心将可溶蛋白和细胞碎片及不可溶蛋白沉淀分离。
12、优选地，步骤（3）中，加入10 mm dtt 37℃还原反应1h，再加入50 mm iaa，室温避光反应45 min，加入胰酶，37℃过夜酶切，随后加入10%三氟乙酸终止酶切反应。
13、进一步优选地，所述蛋白与胰酶的质量比为50:1。
14、优选地，步骤（4）中，c18小柱对肽段脱盐，将洗脱液离心浓缩至干燥后，加入15 μl0.1%甲酸水溶液重悬，测定肽段浓度。
15、进一步优选地，所述质谱仪的参数如下：流动相a：0.1%甲酸水溶液；流动相b：0.1%甲酸与80%乙腈的水溶液；固定相为自制的c18色谱柱；液相梯度为：0~46 min，b相从6%线性增加至25%，46~53 min，b相从25%线性增加至40%，53~57 min，b相从40%线性增加至100%，57~60 min，b相在100%时保持4 min。
16、为了实现以上目的，本专利技术提供的天然药物分子槲皮素靶标的鉴定方法所采取的技术方案为：
17、一种天然药物分子槲皮素靶标的应用，所述靶标在槲皮素及其衍生药物抗衰、抗炎试剂及试剂盒中的应用。
18、本专利技术首先通过细胞热迁移串联质谱（cetsa-ms）高通量筛选槲皮素的潜在互作靶标；
19、对发生热迁移的蛋白其稳定性进行评估确认这些蛋白群体本身不存在热稳定性的差异，槲皮素作为变量使其对热发生了增强对热稳定性和去对热稳定性的改变；
20、从这些靶标中进一步挑选熔解温度变化较大的三个靶标通过免疫印迹（wb）做交叉验证；
21、在取得一致性结果后，进一步分析这些互作靶标与槲皮素结合口袋的共性特征，基于发现的共性特征挑选可靶向的口袋，通过分子对接计算出其结合能和结合模式，评估其结合能力；
22、基于前述证据，进一步通过下拉试验对三种直接互作靶标进行确证。
23、有益效果：
24、本专利技术采用cetsa-ms蛋白质组学方法鉴定了细胞内蛋白与槲皮素的互作，考虑到了靶蛋白实际的生理环境，结果可靠性优于体外试验手段。
25、本专利技术首次给出了槲皮素与gsk3a、cbr1和mapk1直接互作的证据，可推动槲皮素靶向gsk3a、cbr1和mapk1靶点的应用。
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1.一种天然药物分子槲皮素的靶标，所述靶标为GSK3A、CBR1和MAPK1中至少一种。
2.一种如权利要求1所述的天然药物分子槲皮素靶标的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的天然药物分子槲皮素靶标的鉴定方法，其特征在于，步骤（1）中，在37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养细胞至80%汇合度，加入浓度为100μM槲皮素与细胞共孵育，弃去培养基，加入 PBS缓冲液，收集细胞悬液至离心管，加入PBS清洗皿合并细胞悬液，离心，弃上清，向细胞沉淀中加入PBS，混匀后，使用液氮反复冻融破裂细胞，提取蛋白，通过高速离心将可溶蛋白和细胞碎片及不可溶蛋白沉淀分离。
4.根据权利要求2所述的天然药物分子槲皮素靶标的鉴定方法，其特征在于，步骤（3）中，加入10 mM DTT 37℃还原反应1h，再加入50 mM IAA，室温避光反应45 min，加入胰酶，37℃过夜酶切，随后加入10%三氟乙酸终止酶切反应。
5.根据权利要求4所述的天然药物分子槲皮素靶标的鉴定方法，其特征在于，所述蛋白与胰酶的质量比为50:1。
7.根据权利要求6所述的天然药物分子槲皮素靶标的鉴定方法，其特征在于，所述质谱仪的参数如下：流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸与80%乙腈的水溶液；固定相为自制的C18色谱柱；液相梯度为：0~46 min，B相从6%线性增加至25%，46~53 min，B相从25%线性增加至40%，53~57 min，B相从40%线性增加至100%，57~60 min，B相在100%时保持4min。
8.一种如权利要求1所述的天然药物分子槲皮素靶标的应用，所述靶标在槲皮素及其衍生药物抗衰、抗炎试剂及试剂盒中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种天然药物分子槲皮素的靶标，所述靶标为gsk3a、cbr1和mapk1中至少一种。
2.一种如权利要求1所述的天然药物分子槲皮素靶标的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的天然药物分子槲皮素靶标的鉴定方法，其特征在于，步骤（1）中，在37℃、5% co2的细胞培养箱中培养细胞至80%汇合度，加入浓度为100μm槲皮素与细胞共孵育，弃去培养基，加入 pbs缓冲液，收集细胞悬液至离心管，加入pbs清洗皿合并细胞悬液，离心，弃上清，向细胞沉淀中加入pbs，混匀后，使用液氮反复冻融破裂细胞，提取蛋白，通过高速离心将可溶蛋白和细胞碎片及不可溶蛋白沉淀分离。
4.根据权利要求2所述的天然药物分子槲皮素靶标的鉴定方法，其特征在于，步骤（3）中，加入10 mm dtt 37℃还原反应1h，再加入50 mm iaa，室温避光反应45 min，加入胰酶，37℃过夜酶切，随后加入10%三氟乙酸终止酶切反应。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：夏总平，邓志芬，白琳，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：
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