【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及烟草来源的羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶突变体的制备及应用，属于酶工程。
技术介绍
1、绿原酸(chlorogenic acid，cga)是天然的酚酸类化合物，分子式为c16h18o9，相对分子质量为354.309。从结构上看，绿原酸是一分子咖啡酸和一分子奎宁酸缩合形成的脂。绿原酸具有较好的抗氧化、抗菌、抗炎和保护神经的活性，其在保健品和医药等行业表现出巨大的应用潜力。此外，绿原酸还可以作为紫锥菊中重要的化合物菊苣酸的前体物。近年来，绿原酸的合成受到了越来越多研究者的关注。
2、目前，绿原酸的生产主要依赖于植物提取法，但是生产效率受到了季节和植物组织含量低等因素的影响。传统化学合成法合成绿原酸涉及到多步反应，得率较低，也不适用于大规模的生产。目前通过在大肠杆菌和酿酒酵母体内重构含有羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶和咖啡酰辅酶a为核心的微生物合成途径，实现了绿原酸的合成。然而，羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶底物专一性差，在催化生成绿原酸的同时，又可以催化一分子左旋多巴辅酶a和一分子奎宁酸缩合产生副产物，限制了绿原酸的高效合成。因此，筛选具有更好底物专一性的羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶对于改造高产绿原酸的大肠杆菌菌株具有重要的意义。
技术实现思路
1、基于上述现状，本专利技术利用基因工程和酶工程的手段，鉴定副产物的生成，突变降低了羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶对左旋多巴辅酶a的底物选择性，减少副产物的产生，为绿原酸的高效合成创造条件。
2、本专利技术提供了对
3、在一种实施方式中，所述烟草(nicotiana tabacum)来源的羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶具有如seq id no.1所示的氨基酸序列。
4、在一种实施方式中，所述突变体是第200位脯氨酸(pro)突变为丙氨酸(ala)，获得的突变体命名为p200a，其氨基酸序列如seq id no.3所示。
5、在一种实施方式中，所述突变体是第200位脯氨酸(pro)突变为甲硫氨酸(met)，突变体命名为p200m，其氨基酸序列如seq id no.4所示。
6、在一种实施方式中，所述突变体是第200位脯氨酸(pro)突变为天冬氨酸(asp)，突变体命名为p200d，其氨基酸序列如seq id no.5所示。
7、在一种实施方式中，所述突变体是第284位丙氨酸(ala)突变为谷氨酸(glu)，突变体命名为a284e，其氨基酸序列如seq id no.6所示。
8、在一种实施方式中，所述突变体是第361位苏氨酸(thr)突变为天冬氨酸(asp)，突变体命名为t361d，其氨基酸序列如seq id no.7所示。
9、在一种实施方式中，所述突变体是第200位脯氨酸(pro)突变为甲硫氨酸(met)，并将第284位丙氨酸(ala)突变为谷氨酸(glu)，突变体命名为p200m/a284e，其氨基酸序列如seq id no.8所示。
10、本专利技术提供了编码所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶突变体的基因。
11、本专利技术提供了携带所述基因的质粒。
12、在一种实施方式中，所述质粒包括但不限于pet系列、duet系列。
13、本专利技术提供了表达所述烟草来源的羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶突变体的重组微生物细胞。
14、在一种实施方式中，所述微生物包括但不限于大肠杆菌。
15、在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括但不限于e.coli bl21(de3)系列。
16、在一种实施方式中，所述重组大肠杆菌利用petduet表达所述烟草来源的羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶突变体。
17、本专利技术还提供了所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶突变体在提高微生物绿原酸产量中的应用。
18、在一种实施方式中，所述微生物是具有绿原酸合成能力的微生物。
19、在一种实施方式中，所述应用是将所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶突变体在具有绿原酸合成途径的大肠杆菌中表达。
20、在一种实施方式中，所述大肠杆菌为重组大肠杆菌bl21(de3)δtyrrδmeni，公开于论文《efficient production of chlorogenic acid in escherichia coli viamodular pathway and cofactor engineering》。
21、本专利技术还提供了一种发酵生产绿原酸的方法，所述方法是将表达所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶突变体的重组大肠杆菌在发酵培养基中培养至od600＝0.8-1.0，加入终浓度为0.1±0.01mm的iptg诱导。
22、在一种实施方式中，所述方法是先将重组大肠杆菌在lb培养基中，于35～37℃培养10-12h获得种子液，再将种子液接种至发酵培养基中培养。
23、在一种实施方式中，发酵至少48h。
24、本专利技术提供了所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶，或所述基因，或所述微生物细胞在生产绿原酸中的应用。
25、本专利技术还请求保护所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶突变体在食品、生物医药、化工、饲料或化妆品行业中的应用。
26、有益效果：本专利技术提供了一系列烟草来源的羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶的突变体，该突变体通过降低对左旋多巴辅酶a的底物选择性，从而减少副产物的生成，增加了绿原酸的合成。在适当的培养条件下，突变体p200a、p200m、p200d、a284e、t361d、p200m/a284e的副产物分别减少了10.6％、27.2％、11.2％、28.3％、10.5％、45.6％，绿原酸的产量分别提高了33mg/l、62mg/l、32mg/l、63mg/l、35mg/l、88mg/l。
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1.羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶突变体，其特征在于，相对于SEQ ID NO.1所示的出发序列，具有第200位、第284位、第361位中一个或多个位点的氨基酸突变。
2.根据权利要求1所述的羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶突变体，其特征在于，所述突变包括(a)～(f)的至少一种：
3.编码权利要求1或2所述羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的表达载体。
5.表达权利要求1或2所述突变体，或含有权利要求3所述基因的微生物细胞。
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，是含有权利要求1或2所述突变体的BL21(DE3)ΔtyrRΔmenI。
7.权利要求1或2所述的羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶突变体在提高微生物绿原酸产量中的应用。
8.一种发酵生产绿原酸的方法，其特征在于，将表达所述羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶突变体的重组大肠杆菌在发酵培养基中培养至OD600＝0.8-1.0，加入终浓度为0.1±0.01mM的IPTG诱导。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在
10.权利要求1或2所述的羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶，或权利要求3所述的基因，或权利要求5所述的微生物细胞，或权利要求6所述的重组大肠杆菌在生产绿原酸中的应用。
...【技术特征摘要】
1.羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶突变体，其特征在于，相对于seq id no.1所示的出发序列，具有第200位、第284位、第361位中一个或多个位点的氨基酸突变。
2.根据权利要求1所述的羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶突变体，其特征在于，所述突变包括(a)～(f)的至少一种：
3.编码权利要求1或2所述羟基肉桂酰辅酶a奎宁酸转移酶突变体的基因。
4.携带权利要求3所述基因的表达载体。
5.表达权利要求1或2所述突变体，或含有权利要求3所述基因的微生物细胞。
6.一种重组大肠杆菌，其特征在于，是含有权利要求1或2所述突变体的bl21(de3)δtyrrδmeni。
7.权利要求1...
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