【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开了一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体及其在l-丝氨酸生产中的应用，属于酶工程。
技术介绍
1、l-丝氨酸(l-serine，简称l-ser)，作为一种非必需氨基酸，在生物体内的多种氨基酸、磷脂、胆碱、嘌呤等重要物质的生物合成中起着不可或缺的作用，同时它是生物体内活性一碳单位的重要来源。近年来，l-丝氨酸在食品、生物医药以及化妆品领域也展现出了不可思议的潜力。l-丝氨酸作为营养补充剂用于补充人体必须的营养元素添加进食品和功能性饮料中。在制药行业中，l-丝氨酸不仅是重要的医药原料，其衍生物也有着非常广泛的用途。化妆品中也广泛添加l-丝氨酸用于增加细胞表面活性以及抗衰老。目前工业上生产l-丝氨酸主要是使用化学法，但其具有成本高、转化效率低和环境污染问题严重等缺点。而报道的微生物法中，活性和产量较低，因此提高丝氨酸羟甲基转移酶的酶活力对于l-ser工业生产具有重要意义。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供一种丝氨酸羟甲基转移酶突变体及其在l-丝氨酸生产中的应用。本专利技术以柴油食烷菌来源的丝氨酸羟甲基转移酶为亲本，突变得到了丝氨酸羟甲基转移酶突变体，本专利技术的丝氨酸羟甲基转移酶突变体的酶活力及催化能力均有所提高，将其构建到大肠杆菌，酶转化效率较高，具有良好的工业前景。
2、本专利技术的第一个目的是提供一种丝氨酸羟甲基转移酶，所述丝氨酸羟甲基转移酶以seq id no.3所示的氨基酸序列作为亲本，对亲本进行了如下(a)-(c)所示的一个或多个突变：p>
3、(a)第160位谷氨酸突变为亮氨酸；
4、(b)第193位谷氨酸突变为谷氨酰胺；
5、(c)第266位谷氨酸突变为甲硫氨酸。
6、在一种实施方式中，所述丝氨酸羟甲基转移酶以seq id no.3所示的氨基酸序列作为亲本，将亲本第160位谷氨酸突变为亮氨酸、第193位谷氨酸突变为谷氨酰胺、第266位谷氨酸突变为甲硫氨酸，得到如氨基酸序列如seq id no.1所示的丝氨酸羟甲基转移酶。
7、本专利技术第二个目的是提供编码所述丝氨酸羟甲基转移酶的基因。
8、在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9、本专利技术的第三个目的是提供一种含有所述基因的载体。
10、对含有上述基因的载体种类，没有特别限定，可以是质粒、噬菌体、粘粒、病毒、yac载体、穿梭载体等任意的载体。进一步的，该载体没有限定，优选为能在细菌内，如能在大肠杆菌内表达所述基因的载体。更进一步的，作为优选的例子，没有限定，所述载体可以是质粒pet28a。
11、本专利技术的第四个目的是提供一种重组细胞，所述重组细胞含有上述基因，或含有上述载体。
12、在一种实施方式中，通过将所述基因或所述载体导入宿主，就能够得到本专利技术所述的重组细胞。
13、在一种实施方式中，所述宿主可以选自细菌、真菌等的微生物。作为细菌的例子，可以列举大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等，作为真菌的例子，可以列举毕赤酵母、酿酒酵母等。优选为大肠杆菌或其突变株，作为优选的例子，没有限定，所述宿主可以是大肠杆菌bl21(de3)。
14、本专利技术的第五个目的是提供一种l-丝氨酸生产方法，所述方法为在辅酶存在的情况下，将含有甘氨酸和甲醛的底物与所述丝氨酸羟甲基转移酶或所述重组细胞混合反应，生产l-丝氨酸；所述辅酶包括四氢叶酸和磷酸吡哆醛。
15、在一种实施方式中，所述四氢叶酸的浓度为1-20mm，优选为10mm。
16、在一种实施方式中，所述磷酸吡哆醛的浓度为0.1-1mm，优选为0.4mm。
17、在一种实施方式中，所述甘氨酸的浓度为0.5-2m，优选为1.2m甘氨酸。
18、在一种实施方式中，所述甲醛的浓度为0.5-2m，优选为1.2m。
19、在一种实施方式中，所述反应的温度为30-70℃，优选为30-50℃，更优选为40℃。
20、在一种实施方式中，所述反应的ph为4-10，优选为ph 6-8，更优选为ph 7。
21、本专利技术的第六个目的是提供一种酶制剂，所述酶制剂含有上述丝氨酸羟甲基转移酶或上述重组细胞。
22、本专利技术的第七个目的是提供所述的丝氨酸羟甲基转移酶或所述重组细胞在食品领域中的应用。
23、在一种实施方式中，所述应用包括将所述的丝氨酸羟甲基转移酶或所述重组细胞用于l-丝氨酸或含l-丝氨酸产品的生产。
24、有益效果：
25、本专利技术通过将柴油食烷菌来源的丝氨酸羟甲基转移酶第160位谷氨酸替换成亮氨酸、第193位谷氨酸替换成谷氨酰胺和第266位谷氨酸替换成甲硫氨酸，获得了丝氨酸羟甲基转移酶突变体，不仅提了高丝氨酸羟甲基转移酶的酶活性和热稳定性，还增强了该酶在大肠杆菌中合成l-丝氨酸的能力，使其更适应于工业生产。突变体相较于野生型酶，具体提升如下：
26、(1)比酶活力提升了35.0％；
27、(2)对底物显示出了更强的亲和力：动力学常数km从10.38μm，降低为了4.36μm；
28、(3)催化效率出现显著提升：转换数kcat/km从0.35s-1μm-1提升至1.09s-1μm-1；
29、(4)稳定性提升：40℃、ph 6.5的环境下孵育24h后，野生型酶残余酶活为初始的31.7％，突变体残余酶活为初始的77.5％；
30、此外，在40℃下反应24h条件下，菌株e.coli bl21/pet28a-adshmte160l/e193q/e266m的l-丝氨酸最终产量高达92.88g/l，是e.coli bl21/pet28a-adshmt的3.26倍。
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1.一种丝氨酸羟甲基转移酶，其特征在于，所述丝氨酸羟甲基转移酶以SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列作为亲本，将亲本第160位谷氨酸突变为亮氨酸、第193位谷氨酸突变为谷氨酰胺、第266位谷氨酸突变为甲硫氨酸；所述丝氨酸羟甲基转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.编码权利要求1所述的丝氨酸羟甲基转移酶的基因。
3.含有权利要求2所述基因的载体。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求2所述基因，或含有权利要求3所述的载体。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以大肠杆菌为宿主。
6.一种L-丝氨酸生产方法，其特征在于，所述方法为在辅酶存在的条件下，将含有甘氨酸和甲醛的底物与权利要求1所述丝氨酸羟甲基转移酶，或权利要求4或5所述重组细胞混合反应，生产L-丝氨酸；所述辅酶包括四氢叶酸和磷酸吡哆醛。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述反应的温度为30-55℃。
8.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂含有权利要求1所述丝氨酸羟甲基转移酶，或
9.权利要求1所述丝氨酸羟甲基转移酶，或权利要求4或5所述重组细胞在食品领域中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括将所述的丝氨酸羟甲基转移酶或所述重组细胞用于L-丝氨酸或含L-丝氨酸产品的生产。
...【技术特征摘要】
1.一种丝氨酸羟甲基转移酶，其特征在于，所述丝氨酸羟甲基转移酶以seq id no.3所示的氨基酸序列作为亲本，将亲本第160位谷氨酸突变为亮氨酸、第193位谷氨酸突变为谷氨酰胺、第266位谷氨酸突变为甲硫氨酸；所述丝氨酸羟甲基转移酶的氨基酸序列如seq idno.1所示。
2.编码权利要求1所述的丝氨酸羟甲基转移酶的基因。
3.含有权利要求2所述基因的载体。
4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求2所述基因，或含有权利要求3所述的载体。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以大肠杆菌为宿主。
6.一种l-丝氨酸生产方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，滕子心，潘学玮，徐美娟，杨套伟，张显，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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