一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法技术

技术编号：40578585 阅读：13 留言：0更新日期：2024-03-06 17:20

本发明专利技术公开了一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法，(1)入门载体的构建：以质粒RS300为模板，通过PCR扩增反应获得包含靶点、BsaI内切酶识别和切割位点的DNA片段，通过酶切连接反应获得完整入门载体；(2)通过LR反应进行表达载体的构建：利用gateway体系构建表达载体，利用LR酶将入门载体与含有启动子的表达载体进行LR反应从而获得完整表达载体；(3)将步骤(2)获得的表达载体转化进大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行酶切鉴定；(4)酶切鉴定后进行转基因操作直至获取转基因植株阳性苗。本申请在构建基因敲低的表达载体时，可以将多个含有靶点的序列连接在一起同时连接进入门载体，效率较高。

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【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物，尤其涉及一种高效的microrna基因敲低载体构建方法。

技术介绍

1、micrornas(mirnas)是一种非编码小分子rna，能够在基因调控中起着至关重要作用。植物mirna是一类由21-22nt核苷酸组成的内源小rna，通过靶向rna切割或翻译抑制来抑制基因表达(achkar,n.p.,cambiagno,d.a.,and manavella,p.a.(2016).mirnabiogenesis:a dynamic pathway.trends plant sci.21,1034–1044)。mirnas的结构具有一定的特殊性：在3’端有两个核酸突出的不对称结构。在植物中，mirna前体先被加工成mirna-mirna双链后被加载到以argonaute 1(ago1)为中心的rna诱导沉默复合体rna-induced silencing complex(risc)中，然后参与靶标mrna降解调控(schwarz,d.s.,hutvagner,g.,du,t.,xu,z.,aronin,n.and zamore,p.d.(2003)asymmetry in theassembly of the rnai enzyme complex.cell 115,199–208.)。

2、artificial micrornas(amirnas)是基于内源性mirna前体设计的，是模仿mirnas的结构，用于沉默特定目的基因的一种人工合成的由21个核苷酸组成的mirna(yu,s.andpilot,g.

3、artificial micrornas为基因敲低提供了新的方法，帮助人们更好的对目的基因开展各类研究。但是现有的artificial micrornas工作系统存在以下问题：(1)传统方法中只能针对单一靶点设计敲低载体，想要获取多个基因同时敲低的突变体只能通过构建多个载体并进行多次转基因操作获得。上述方法耗时长且针对某一基因只设计单一靶点存在较高脱靶风险。(2)在构建基因敲低的表达载体时依赖于传统的内切酶，效率较低。

技术实现思路

1、本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种高效的microrna基因敲低载体构建方法。

2、为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：

3、一种高效的microrna基因敲低载体构建方法，流程图如图6所示，具体包括以下步骤：

4、(1)入门载体的构建：以质粒rs300为模板，通过pcr扩增反应获得包含靶点、bsai内切酶识别和切割位点的dna片段，所用引物包括含有靶点序列的引物和位于两端的引物，通过酶切连接反应获得完整入门载体(rebecca schwab,stephan ossowski,markusriester,norman warthmann,and detlef weigel.(2006)highly specific genesilencing by artificial micrornas in arabidopsis plant cell 18:1121-1133)(stephan ossowski,rebecca schwab,detlef weigel(2008)gene silencing in plantsusing artificial micrornas and other small rnas the plant journal 53(4),674-690)(warthmann n,chen h,ossowski s,weigel d,hervép.(2008)highly specific genesilencing by artificial mirnas in rice plos one 3(3):e1829),入门载体碱基序列如seq id no.2；

5、(2)通过lr反应进行表达载体的构建：利用gateway体系构建表达载体，使用lr酶进行lr反应，利用lr酶将入门载体与含有启动子的表达载体进行lr反应从而获得完整表达载体，电泳确定入门载体和表达载体的浓度，体系中加入入门载体和表达载体的总量比为3：1，加2.5μl lr酶，水补至5μl，25℃孵育过夜(但不超过16h)；

6、(3)将步骤(2)获得的连接产物转化进大肠杆菌感受态细胞，对阳性克隆进行酶切鉴定；

7、(4)酶切鉴定后进行转基因操作直至获取转基因植株阳性苗。

8、上述方案中优选的是，其特征在于：所述步骤(1)中含有靶点序列的引物包括引物i、引物ii、引物iii、引物iv，位于两端的引物包括引物a、引物b。其中引物i、引物ii、引物iii、引物iv序列采用目的基因靶点替换其中的“n”获得，靶点序列插入引物i、引物iii时直接复制替换“n”，靶点序列插入引物ii、引物iv时需要将靶点序列的互补序列替换“n”，

9、引物i gannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnntctctcttttgtattcc 本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中含有靶点序列的引物(P)包括引物I、引物II、引物III、引物IV，位于两端的引物包括引物A、引物B，通过多靶点串联构建质粒实现多靶点基因敲低。

3.根据权利要求2所述的一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法，其特征在于：引物I、引物II、引物III、引物IV序列采用目的基因靶点替换其中的“N”获得，靶点序列插入引物I、引物III时直接复制替换“N”，靶点序列插入引物II、引物IV时需要将靶点序列的互补序列替换“N”。

4.根据权利要求2所述的一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法，其特征在于：所述引物A和引物B针对多靶点基因敲除，以BsaI内切酶作为构建质粒过程中酶切使用的酶，BsaI内切酶在相邻的靶标mRNA之间形成互补的粘性末端序列，引物A、引物B设计过程中所选用的引物序列遵循以下规则：

5.根据权利要求4所述的一种高效的microRN

6.根据权利要求1所述的一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法，其特征在于：步骤(1)中针对靶标mRNA的PCR扩增反应步骤如下：

7.根据权利要求1所述的一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法，其特征在于：步骤(1)中酶切连接反应体系如下：

8.根据权利要求4所述的一种高效的microRNA基因敲低载体构建方法，其特征在于：步骤(3)中具体操作为：将大肠杆菌感受态置于冰上孵化，加入LR反应产物置于冰上30min，42℃水浴热激45s，计时结束后立刻放冰上2min，再加500μL液体LB，37℃摇床200rpm培养1h，培养后涂布到含有浓度为1‰Spe抗性的固体LB平板上，37℃培养箱倒置培养过夜；培养结束后直接接菌、摇菌过夜培养(约12h)，第二天抽质粒进行酶切鉴定。

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【技术特征摘要】

1.一种高效的microrna基因敲低载体构建方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种高效的microrna基因敲低载体构建方法，其特征在于：所述步骤(1)中含有靶点序列的引物(p)包括引物i、引物ii、引物iii、引物iv，位于两端的引物包括引物a、引物b，通过多靶点串联构建质粒实现多靶点基因敲低。

3.根据权利要求2所述的一种高效的microrna基因敲低载体构建方法，其特征在于：引物i、引物ii、引物iii、引物iv序列采用目的基因靶点替换其中的“n”获得，靶点序列插入引物i、引物iii时直接复制替换“n”，靶点序列插入引物ii、引物iv时需要将靶点序列的互补序列替换“n”。

4.根据权利要求2所述的一种高效的microrna基因敲低载体构建方法，其特征在于：所述引物a和引物b针对多靶点基因敲除，以bsai内切酶作为构建质粒过程中酶切使用的酶，bsai内切酶在相邻的靶标mrna之间形成互补的粘性末端序列，引物a、引物b设计过程中所选用...

【专利技术属性】
技术研发人员：张楠楠，罗林杰，张浩然，刘利，崔佳佳，李雪阳，朱本强，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：

全部详细技术资料下载我是这个专利的主人