【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种多重耐药寡养单胞菌的基因敲除方法。
技术介绍
1、嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)是一种革兰氏阴性菌。其中，嗜麦芽窄食单胞菌为寡养单胞菌的一种模式菌，作为一种全球性的致病菌，可引起人的呼吸道感染，这种菌在水、土壤、食物、植物以及人和动物的皮肤、呼吸道和胃肠道中普遍存在。寡养单胞菌感染人可引起肺炎、败血症、心内膜炎和尿路感染，是低免疫功能者中发病率和病死率较高的条件致病菌。寡养单胞菌能合成两种不同类型的β-内酰胺酶，l1和l2这两种类型的β-内酰胺酶是引起细菌对β-内酰胺酶耐药性的重要原因。其中，l1是具有两个zn2+活性位点，能水解大多数碳青霉烯类药物、β-内酰胺类及其酶抑制剂等抗菌药物。此外，多粘菌素是非核糖体合成的阳离子抗菌肽，是治疗碳青霉烯耐药型致病菌的关键临床用药。由于抗生素的不科学使用，导致抗生素的耐药情况急剧上升，因此多粘菌素被誉为“抗革兰氏阴性菌感染的最后一道防线”。
2、寡养单胞菌mer1是从医疗污水中分离的多重耐药菌，来源于抗生素富集程度较高的环境中。mer1对多种重要的临床抗生素耐药(碳青霉烯类、多粘菌素e等)，限制了其采用基因组编辑开展基础研究工作。而且，现阶段寡养单胞菌主要采用双抗生素耐药标签筛选或者引入抗性基因的插入失活方法，操作繁琐、抗性残留等问题进一步制约其多位点编辑。
3、因此，一种多重耐药寡养单胞菌的基因敲除方法亟待提出。
技术实现思路
1、为解决现
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：
3、本专利技术提供一种多重耐药寡养单胞菌的基因敲除方法，包括以下步骤：
4、s1、构建重组自杀载体：设计反向pcr引物扩增缺失抗性标签的线性化载体，与从pbad33克隆到的抗性基因通过一步克隆体外连接，利用热转法导入到e.coli dh5ɑ，涂布在含有相应抗生素培养平板上挑取转化子并进行验证，构建载体命名为pex18tc-cmr；
5、s2、构建目的基因的敲除载体：设计待敲除目的基因上下游同源臂扩增引物，在上游同源臂选择bamhⅰ和hindⅲ酶切位点，插入片段1连接上游同源臂u，插入片段2连接下游同源臂d；进行pcr扩增出目的基因的上下游同源臂u、d后，利用一步克隆法技术在体外将其与bamhⅰ和hindⅲ双酶切后的线性化载体pex18tc-cmr连接；
6、s3、构建基因敲除菌株：利用热转法将敲除载体转化到大肠杆菌2,6-二氨基庚二酸营养缺陷(δdap)菌株wm3064中，培养需加入2,6-二氨基庚二酸(2,6-dap)。以此为供体菌，寡养单胞菌mer1为受体菌，进行双亲本接合；之后，由于自杀质粒载体pex18tc-cmr无法在寡养单胞菌中独立复制，其接合转化到宿主菌株后会插入到mer1的基因组上；利用载体上的氯霉素chl抗性基因，筛选出第一次交换的重组转化子；
7、s4、将步骤s3获得的菌株过夜扩培后，利用载体上携带的反筛选标记sacb基因，在反筛选平板上筛选发生第二次交换的重组子，即已整合入基因组、携带同源臂并缺失目的基因dna片段随质粒载体从基因组环出脱落，实现基因无缝敲除。
8、优选的，所述步骤s1包括：
9、s11、以大肠杆菌dh5α/pex18tc单菌落为模板，利用反向pcr技术，设计pcr扩增引物18tc-f、r将原始载体进行扩增并切胶回收纯化得到去除tet四环素抗生素抗性基因部分的线性化载体，引物序列如seq id no.1和seq id no.2所示；
10、s12、以dh5α/pbad33单菌落为模板，设计pcr引物catcm-f、r，引物序列如seq idno.5和seq id no.6所示，扩增得到cmr基因；
11、s13、连接步骤：s11与s12抗性基因片段重组连接，pcr克隆并纯化后一步克隆连接的产物热转法到e.coli dh5ɑ；待含有氯霉素的平板长出菌落后，挑取大小合适的单菌落进行pcr验证，得到重组质粒为自杀载体pex18tc-cmr。设计引物pex18tc-f、r进行pcr扩增和琼脂糖凝胶验证，引物序列如seq id no.3和seq id no.4所示，-80℃保藏dh5ɑ/pex18tc-cmr。
12、本专利技术相较于现有技术，具有以下有益效果：
13、本专利技术将自杀载体导入寡养单胞菌中进行基因敲除菌株筛选，操作简单高效，且准确率高。利用蔗糖平板和sacb基因，可以使得到的自杀载体构建敲除菌株筛选时，阳性转化子获取效率和准确率提高。
14、本专利技术构建的自杀质粒能在大肠杆菌dh5α稳定存在，但该质粒在大多细菌中不能随宿主基因组复制，宿主表现出对应抗生素抗性必须借助同源臂整合质粒序列至基因组中。此外，该载体含有sacb基因，该基因编码的蔗糖酶能催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖，果糖进一步聚合成高分子量的果聚糖，果聚糖积累对细胞存在毒性作用，造成菌体死亡，便于二次反向筛选获得载体环出的转化子，最终不残留抗性基因和无痕敲除基因。
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1.一种多重耐药寡养单胞菌的基因敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的多重耐药寡养单胞菌的基因敲除方法，其特征在于，所述步骤S1包括：
【技术特征摘要】
1.一种多重耐药寡养单胞菌的基因敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：
2....
【专利技术属性】
技术研发人员：李骏，万爽，谢琳琳，曹广祥，唐宇航，吕娜，周雯雯，孙超，陆劲锋，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：
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