【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，尤其是涉及一种适配体修饰的融合细胞囊泡疫苗及其制备方法和其作为靶向抗肝癌的应用。
技术介绍
1、肝癌，尤其是肝细胞癌，是与癌症死亡有关的主要原因之一，其发病率在全球范围内呈上升趋势，肝切除术仍然是治疗肝癌的主要手段，但多数患者确诊时已是中晚期，错过了手术治疗的最佳时机。虽已有药物例如索拉菲尼可用于肝癌晚期无法手术患者的治疗，但能起到的也仅仅是缓解或维持肿瘤的相对稳定，无法完全治愈。
2、免疫微环境在肝癌的发生和发展中起着至关重要的作用，免疫系统能够参与杀伤肿瘤细胞的过程，免疫系统异常也与肿瘤的发生和发展高度相关，因此可以说肿瘤与免疫之间存在着相互作用的关系。t细胞在抗肿瘤反应中具有重要地位，t细胞的活化过程涉及两种不同的信号：t细胞受体与主要组织相容性复合体（major histocompatibilitycomplex, mhc）-肽复合物的结合，共刺激分子cd28和b7（cd80和cd86）之间的相互作用，简单来说，抗原提呈细胞（主要是dc）先识别并将肿瘤抗原呈递给t细胞，诱导t细胞增殖分化为具有特异性杀伤功能的ctl，ctl来到肿瘤部位，识别并对肿瘤产生杀伤作用。但由于免疫抑制以及无法有效识别肿瘤抗原，导致t细胞无法分化为ctl以及有效的杀伤肿瘤，此外，ctl跟随血液循环不能很好的聚集在肿瘤部位，不具有良好的靶向性。因此，如何高效诱导ctl并能够让更多的ctl浸润在肿瘤部位，对肿瘤产生杀伤作用抑制肿瘤的生长，是现在临床亟待解决的难题之一。
技术实现思路b>
1、为了克服现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种适配体修饰的融合细胞囊泡疫苗及其制备方法和其作为靶向抗肝癌的应用。本专利技术将人外周血分离出的树突状细胞与人原发性肝癌细胞hepg2融合，并将融合细胞制备成囊泡并包裹cxcl9蛋白，外部连接endoglin（cd105）适配体制备成apt-end-mps@cxcl9。
2、本专利技术的技术方案概述如下：
3、（1）融合细胞的制备：将未成熟的树突状细胞培与hepg2按照2:1的比例混合在一起，放入40℃水浴锅中孵育3分钟，离心弃上清后将500 μl peg缓慢加入，轻轻搅拌均匀后再放入40℃水浴锅中孵育3分钟，缓慢加入30 ml pbs，1200 rpm离心5分钟，弃上清后沿着离心管壁缓慢加入2 μl胶原蛋白，轻轻弹离心管底部将沉淀弹起并分散在液体中，将离心管放入37℃水浴锅中孵育30分钟，到时间后加入30ml pbs中止，1200 rpm离心5分钟，弃上清后用10 ml 1640完全培养基重悬，培养7天。
4、(2)融合细胞囊泡疫苗apt-end-cxcl9@cxcl9的制备：吸取200 μl的200 μmendoglin适配体溶液至新的2 ml ep管中，再向管中加入43.2 μl的tcep 还原剂、96.8 μl的超纯水，轻轻吹打混匀后冰上孵育30分钟，到时间后再加入1.2 mg的cls-peg-mal，轻轻吹打直至cls-peg-mal完全溶解，4℃孵育；融合细胞培养第7天，将融合细胞用10 μg/mlcxcl9蛋白溶液重悬，加入到挤推器一端，来回挤推15次后将液体打入离心管中，挤推完后使用0.22 μm滤器过滤挤推所得液体，将过滤后的液体加入到30 kda超滤管中，10000 g离心15分钟，滤管中的液体获得载药囊泡mps@cxcl9；再将mps@cxcl9加入到之前4℃孵育的溶液中，再4℃孵育10分钟，超滤管过滤，10000g离心15分钟，得到滤管中的液体即为连接了适配体的载药囊泡apt-end-cxcl9@cxcl9。
5、以上所述的适配体修饰的融合细胞囊泡疫苗在作为靶向抗肝癌中的应用。
6、本专利技术突出的实质性特点和显著的进步是：
7、实验表明apt-end-mps@cxcl9在体外不仅对hepg2细胞和huvec具有靶向性，同时还能够诱导更多的cd8+ 细胞毒性t淋巴细胞，同时还能够上调hepg2细胞cxcl9的表达，趋化细胞毒性t淋巴细胞的浸润，对肿瘤细胞产生显著的杀伤作用，为解决如何提高肿瘤疫苗疗效并增强疫苗的靶向性提供了新的解决方案。
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1.一种适配体修饰的融合细胞囊泡疫苗及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.权利要求1所述适配体修饰的融合细胞囊泡疫苗在作为靶向抗肝癌中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种适配体修饰的融合细胞囊泡疫苗及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
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