【技术实现步骤摘要】
本申请涉及生物法合成天然染料，尤其涉及一组合成6,6’-二溴靛蓝的工程菌及其制备方法与应用。
技术介绍
1、骨螺紫(tyrian purple)又叫皇家紫(royal purple)、泰尔紫，是从一种地中海骨螺科软体动物中提取出来的紫色染料。现代研究表明，这种染料主要由6,6’-二溴靛蓝(6brig)组成，由于在靛蓝中引入两个溴原子，靛蓝部分的发色团发生了变化，从而表现出新的色泽。
2、骨螺紫稳定持久，不易变色褪色，而是随着风化和日照变得更加鲜亮。天然骨螺紫的获得是非常困难的，每提取1克染料大约需要牺牲8600只海螺。由于独特性和稀缺性，在欧洲漫长的历史上，这种染料比黄金更值钱。时至今日，骨螺紫仍然是一种昂贵的染料，价格仍然高达每克4280美元(2019年的数据)、2439.5欧元(2012年的数据)。同时由于其有序堆叠和重复的共轭π键结构，可以应用于染料敏化太阳能电池和导电材料之中，因此具有很大的挖掘潜力。
3、虽然骨螺紫的结构鉴定已经过去了一百多年，但到现在，骨螺紫的化学合成技术仍然不成熟，无法做到大规模工业生产，主要原因在于无法高效实现吲哚环的6位溴化。在海螺中，负责合成6brig中间体的基因和酶尚未完全阐明，所以无法利用相应的酶进行体外酶促反应或微生物表达合成骨螺紫。根据骨螺紫的分子结构，利用其他来源的酶人工构建骨螺紫的生物合成途径越来越受到重视。目前，全球仅有少数团队掌握通过微生物发酵合成骨螺紫的技术，普遍存在产量低和转化率低的问题。例如，韩国首尔大学的研究人员通过对大肠杆菌进行代谢工程改造，可
技术实现思路
1、本申请的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一组能够降低卤化中间产物次卤酸泄露，提升色氨酸卤化效率，从而提高6,6’-二溴靛蓝产量的工程菌。
2、为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：
3、第一方面，本申请提供了一组合成6,6’-二溴靛蓝的工程菌，包括工程菌tpur04和工程菌tpur05；
4、所述工程菌tpur04为大肠杆菌escherichia coli tpur04，于2023年10月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20232079；
5、所述工程菌tpur05为大肠杆菌escherichia coli tpur05，于2023年10月30日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m 20232080。
6、作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述工程菌tpur04为在大肠杆菌中敲除色氨酸酶tnaa基因，将芳香族氨基酸外排蛋白yddg基因替换为色氨酸6-卤化酶sath基因，插入黄素还原酶fre基因，插入thal基因并对thal基因的v82i位点进行定点突变，回补色氨酸酶tnaa基因；
7、所述工程菌tpur05为在大肠杆菌中敲除色氨酸酶tnaa基因，敲除邻氨基苯甲酸合酶trpe基因，插入黄素单加氧酶fmo基因并对fmo基因的m15l、s23a和c78i位点进行定点突变，回补色氨酸酶tnaa基因。
8、本申请通过敲除tnaa基因、将yddg基因替换为sath基因、插入fre基因、插入thal基因并进行定点突变(v82i)制备得到工程菌tpur04，能够阻断大肠杆菌中色氨酸转变为吲哚形成靛蓝，使色氨酸发生卤化反应的中间产物次卤酸水平降低，提高色氨酸卤化水平，有效提高6-溴色氨酸的产量，进而提高最终产物6,6’-二溴靛蓝的产量。
9、本申请通过敲除tnaa基因、trpe基因、插入fmo基因并进行定点突变(m15l、s23a和c78i)制备得到tpur05，能够使6-溴色氨酸转化为6-溴色吲哚，6-溴色吲哚进一步转化为6,6’-二溴靛蓝，从而提高6,6’-二溴靛蓝的产量。
10、作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述工程菌tpur04含有质粒prsf-fre-thalv82i；所述工程菌tpur05含有质粒prsf-tnaa-fmo*；所述工程菌tpur05含有质粒prsf-tnaa-fmo*；所述质粒prsf-fre-thalv82i中的thalv82i氨基酸序列如seq no.1所示，所述质粒prsf-tnaa-fmo*中的fmo*氨基酸序列如seqno.2所示。
11、作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述工程菌tpur04的制备方法包括以下步骤：
12、a1、利用基因编辑技术将大肠杆菌bl21上的色氨酸酶tnaa基因敲除，得到工程菌tpur01；
13、a2、利用基因编辑技术将步骤a1所得工程菌tpur01中的编码芳香族氨基酸外排蛋白yddg基因替换为色氨酸6-卤化酶sath基因，得到工程菌tpur03；
14、a3、利用基因编辑技术将编码黄素还原酶fre基因和突变的6-色氨酸卤化酶thalv82i基因的质粒prsf-fre-thalv82i转入步骤a2所得工程菌tpur03中，得到工程菌tpur04。
15、作为本申请所述工程菌的优选实施方式，在步骤a2中，所述色氨酸-卤化酶sath基因来源于白色链霉菌streptomyces albus；所述色氨酸6-卤化酶sath基因序列如seq no.3所示；
16、在步骤a3中，所述突变的6-色氨酸卤化酶thalv82i基因由6-色氨酸卤化酶thal基因通过定点突变得到，所述6-色氨酸卤化酶thal基因来源于链霉菌streptomycesalbogriseolus。
17、本申请选用来源于白色链霉菌的色氨酸6-卤化酶和链霉菌的6-色氨酸卤化酶，能够在催化液的作用下使色氨酸发生卤化反应，并且卤素原子取代的是色氨酸6号碳的氢原子，实现色氨酸6号位的卤化。
18、作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述thal基因的定点突变位点为v82i。本申请对thal的v82i、v82r、v82f和v82e分别进行定点突变，通过实验发现v82i位点突变得到的tpur04所合成的6-溴色氨酸产量最高。
19、作为本申请所述工程菌的优选实施方式，所述工程菌tpur05的制备方法包括以下步骤：
20、b1、利用基因编辑技术将大肠杆菌bl21上的色氨酸酶tnaa基因敲除，得到工程菌tpur01；
21、b2、利用基因编辑技术将步骤b1所得工程菌tpur01中的邻氨基苯甲酸合酶trpe基因敲除，得到工程菌tpur02；
22、b3、利用基因编辑技术将编码突变的黄素单加氧酶fmo基因的质粒prsf-tnaa-fmo*整合至步骤b2所得工程菌tpur02中，得到工程菌tpur05。
23、作为本申请所述工程菌的优选实施方式，在步骤b3中，所述突变的黄素单加氧酶fmo基因由黄素单加氧酶fmo基因通过定点突变得到，所述黄素单加氧酶fmo基因来源于噬甲基菌。
24、作为本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组合成6,6’-二溴靛蓝的工程菌，其特征在于，包括工程菌Tpur04和工程菌Tpur05；
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌Tpur04含有质粒pRSF-Fre-ThalV82I；所述工程菌Tpur05含有质粒pRSF-TnaA-FMO*；所述质粒pRSF-Fre-ThalV82I中的ThalV82I氨基酸序列如SEQ NO.1所示，所述质粒pRSF-TnaA-FMO*中的FMO*氨基酸序列如SEQNO.2所示。
3.如权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌Tpur04的制备方法包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的工程菌，其特征在于，在步骤A2中，所述色氨酸-卤化酶SatH基因来源于白色链霉菌Streptomyces albus；所述色氨酸6-卤化酶SatH基因序列如SEQ NO.3所示；
5.如权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌Tpur05的制备方法包括以下步骤：
6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，在步骤B3中，所述突变的黄素单加氧酶FMO基因由黄素单加氧
7.如权利要求1-6任一项所述工程菌在合成6,6’-二溴靛蓝中应用。
8.一种合成6,6’-二溴靛蓝的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述底物为2.5-25mM/L色氨酸和100-300mM/L NaBr，所述催化液包括以下组分：1-15mM MgSO4和5-10g/L营养物；所述营养物为葡萄糖或甘油；
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述催化为在30℃、200rpm下催化16h；
...【技术特征摘要】
1.一组合成6,6’-二溴靛蓝的工程菌，其特征在于，包括工程菌tpur04和工程菌tpur05；
2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌tpur04含有质粒prsf-fre-thalv82i；所述工程菌tpur05含有质粒prsf-tnaa-fmo*；所述质粒prsf-fre-thalv82i中的thalv82i氨基酸序列如seq no.1所示，所述质粒prsf-tnaa-fmo*中的fmo*氨基酸序列如seqno.2所示。
3.如权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌tpur04的制备方法包括以下步骤：
4.如权利要求3所述的工程菌，其特征在于，在步骤a2中，所述色氨酸-卤化酶sath基因来源于白色链霉菌streptomyces albus；所述色氨酸6-卤化酶sath基因序列如seq no.3所示；
5....
【专利技术属性】
技术研发人员：徐富超，许旭，刘仕勋，孙磊，华夏，
申请(专利权)人：南京合谷生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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