【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程学和免疫学，具体涉及一种能够表达口蹄疫病毒颗粒样的细胞池构建与应用。
技术介绍
1、口蹄疫(foot-and-mouth disease，fmd)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouthdisease virus，fmdv)引起的一种急性传染性。该病主要危害家畜养殖，可导致猪、牛、羊等偶蹄动物的减产和死亡从而造成严重的经济损失。目前，该病被我国农业农村部认定为一类动物疫病，对牛、羊、骆驼、鹿进行o型和a型fmd强制免疫，对全国所有的猪进行o型fmd强制免疫。口蹄疫在一年四季均可发生，冬季最为严重。fmdv是小rna病毒科、口疮病毒属的成员，是一种非囊膜病毒。其由病毒核酸与病毒衣壳组成，形状呈正二十面体，直径在25-30nm。fmdv的病毒衣壳由vp4、vp2、vp3、vp1等四种衣壳蛋白组成，其中vp4和vp2由vp0自裂解而来。vp0、vp3、vp1由病毒p12a前体衣壳蛋白被病毒3c蛋白酶(3cpro)切割得到。
2、目前，在fmd流行地区的主要控制方法是通过定期接种疫苗，然而，fmd仍然在大约三分之二的国家流行，我国流行的主要流行o型、a型和asia1型。患病动物可分泌大量的病毒颗粒，通过气溶胶的方式直接感染健康动物，虽然口蹄疫在感染动物中造成的死亡率很低，但可导致易感动物群接近100％发病率，且严重影响动物的生长、产奶量以及动物和动物产品的国际贸易。
3、病毒样颗粒(virus-like particles，vlps)是一种多亚单位、可自我组装的蛋白质结构，与亲本病毒的形
4、目前，国内外制备fmd vlps主要基于原核表达系统、杆状病毒-昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统。原核表达fmd vlps通过小泛素蛋白修饰分子技术融合表达vp0、vp3和vp1，在体外去标签化后组装vlps。杆状病毒-昆虫细胞主要通过细胞感染携带p12a基因和3cpro基因的杆状病毒制备vlps，该表达方式属于瞬时表达，且需要额外检测疫苗的杆状病毒残量以避免不可预测的安全风险。哺乳动物细胞具有优良的蛋白质折叠机制以及复杂、正确的蛋白质修饰机制，是良好的fmd vlps生产宿主细胞。在哺乳动物细胞中也主要通过共表达p12a基因和3cpro基因制备fmd vlps。然而，3cpro已被报道对原核细胞和真核细胞具有强烈的细胞毒性。因此，绝大多数已报道的研究都通过转染携带p12a基因和3cpro基因的质粒瞬时表达p12a蛋白和3cpro以制备fmd vlps，未能将p12a基因和3cpro基因稳定整合至细胞基因组以细胞系或多克隆细胞池的形式fmd vlps。虽然随着哺乳动物细胞瞬时表达技术的进步，瞬时表达制备fmd vlps的成本逐渐下降，但质粒制备、转染试剂制备、重复的转染过程仍然使瞬时表达制备fmd vlps耗时、耗力、成本高昂。因此，利用哺乳动物瞬时表达制备fmd vlps不利用实际的生产应用，需要构建特定的细胞系或细胞池以制备fmd vlps。
技术实现思路
1、本专利技术通过构建含有fmdv基因的重组质粒，并进一步转染至宿主细胞之后筛选得到了一种稳健表达fmd vlps的重组多克隆细胞池，为进一步防范fmdv，以及制备fmdv疫苗提供生物制剂。
2、第一方面，本专利技术提供一种能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池，所述细胞池是通过重组质粒转染宿主细胞获得的，所述重组质粒选自pbbsd-rtta、ptt5-chypbase和pbtet-p12a3copti；
3、其中：
4、重组质粒ptt5-chypbase构建步骤为：将合成的转座酶chypbase片段通过hindⅲ和notⅰ内切酶连接至ptt5载体，命名为ptt5-chypbase；
5、重组质粒pbbsd-rtta构建步骤为：
6、(1)以质粒pbdp为模板、p3和p4为引物扩增目的片段fra1，以质粒pcdna6/v5-hisb为模板，p1和p2为引物扩增目的片段fra2，用dna同源重组酶重组fra1和fra2片段，得到质粒pbbsd；
7、(2)用内切酶bamhⅰ、notⅰ对质粒pegfp-n1、pbbbsd进行双酶切，回收egfp和pbbsd片段，用t4 dna连接酶进行连接，得到pbbsd-egfp，
8、(3)以质粒ptet-on-advanced为模板，p5和p6为引物扩增rtta片段；用内切酶kpnⅰ、bamhⅰ对rtta片段、质粒pbbbsd进行双酶切，回收rtta和pbbsd片段，并用t4 dna连接酶进行连接，得到重组质粒pbbsd-rtta；
9、重组质粒pbtet-p12a3copti构建步骤为：
10、(1)质粒pbdp-p12a3copti的构建：p12a3coptiopti基因由合成得到，并插入至质粒ptt5的hindⅲ和notⅰ酶切位点之间得到质粒ptt5-p12a3copti；
11、(2)以质粒pbdp为模板，将cmv启动子替换为p-sgtre启动子，以pcdna3.1(+)为模板、p11和p12为引物扩增bghp(a)片段，用内切酶bamhⅰ和notⅰ对bghp(a)片段进行双酶切，插入至更换启动子的载体pbdp中，得到质粒pbtet；
12、(3)用内切酶ecorⅰ和bamhⅰ进行双酶切ptt5-p12a3copti，并插入至pbtet的相应酶切位点，得重组质粒pbtet-p12a3copti；
13、本专利技术所用pb转座酶编码序列是高活性pb转座酶的氨基酸序列，并且经过密码子优化，其cdna序列seq id no:1所示，以及p1～p12引物序列如seq id no.2～seq id no.13所示，其中，
14、seq id no:1
15、atgggcagcagcctggacgacgagcacatcctgagcgccctgctgcagagcgacgacgagctggtgggcgaggacagcgacagcgaggtgagcgaccacgtgagcgaggacgacgtgcagagcgacaccgaggaggccttc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池，所述细胞池是通过重组质粒转染宿主细胞获得的，所述重组质粒选自PBBSD-rtTA、pTT5-chyPBase和PBTet-P12A3Copti；
2.如权利要求1所述的能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池，其特征在于，所述口蹄疫病毒选自O型、A型、C型、SAT 1型、SAT 2型、SAT 3型和/或Asia 1型血清型口蹄疫病毒。
3.如权利要求1所述的能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池，其特征在于，所述口蹄疫病毒选自O型血清型口蹄疫病毒。
4.如权利要求1所述的能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池，其特征在于，所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢CHO细胞。
5.一种构建重组细胞池的方法，所述方法包括如下步骤：
6.一种能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池用于制备口蹄疫病毒生物试剂中的应用，所述细胞池是通过重组质粒转染宿主细胞获得的，所述重组质粒选自PBBSD-rtTA、pTT5-chyPBase和PBTet-P12A3Copti。
7.如权利要求6所述的能够表达口蹄
8.如权利要求6所述的能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池用于制备口蹄疫病毒生物试剂中的应用，其特征在于，所述生物试剂还包含口蹄疫病毒样颗粒和/或药学上可接受的载体或免疫佐剂。
9.如权利要求6所述的能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池用于制备口蹄疫病毒生物试剂中的应用，其特征在于，所述疫苗可以是灭活苗、重组蛋白苗、合成肽苗、核酸苗和腺病毒载体苗。
...【技术特征摘要】
1.一种能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池，所述细胞池是通过重组质粒转染宿主细胞获得的，所述重组质粒选自pbbsd-rtta、ptt5-chypbase和pbtet-p12a3copti；
2.如权利要求1所述的能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池，其特征在于，所述口蹄疫病毒选自o型、a型、c型、sat 1型、sat 2型、sat 3型和/或asia 1型血清型口蹄疫病毒。
3.如权利要求1所述的能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池，其特征在于，所述口蹄疫病毒选自o型血清型口蹄疫病毒。
4.如权利要求1所述的能够表达口蹄疫病毒样颗粒的重组细胞池，其特征在于，所述宿主细胞选自中国仓鼠卵巢cho细胞。
5.一种构建重组细胞池的方法，所述方法包括如下步骤：
6.一种能够表达口蹄疫...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙世琪，郭慧琛，谭书桢，董虎，白满元，滕志东，任丽华，吴金恩，张韵，尹双辉，丁耀忠，周静静，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：
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