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【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于核酸检测及生物医药,具体涉及一种通用数字pcr检测体系及其应用。
技术介绍
1、核酸扩增是临床诊断领域不可缺少的检测工具,包括对基因型的区分和患者标本中病原体的准确定量。基于聚合酶链反应(pcr)的技术为微量初始目标序列的扩增提供了强有力的工具。该方法已经从基于凝胶分析的低通量的普通pcr,发展到基于荧光技术的实时定量pcr,以及使用数千个微反应器的数字pcr(ddpcr),且数字pcr具有绝对定量的优势,是第三代pcr检测技术。
2、现有的扩增技术通常采用非选择性的dna染料或目标特异性荧光探针。dna染料适合于低成本的核酸检测和定量,但在多重性和非特异性扩增方面受到限制。相比之下,荧光标记的靶向特异性寡核苷酸(如水解探针或分子信标)基于荧光基团和猝灭基团之间的荧光共振能量转移(fret),并与目标序列直接相互作用。将目标特异性探针序列标记上不同的荧光基团,就能够在反应中高特异性地检测多个目标。但是荧光基团标记会增加分析成本,而且成本的增加与检测目标数量的增加成正比。可见,现有的扩增技术多存在效率低或成本高的弊端。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种通用数字pcr检测体系及其应用,所述通用数字pcr检测体系可以实现高效、通用且低成本的核酸定性定量检测。
2、本专利技术提供了一种通用数字pcr检测体系,包括特异性介导探针、辅助靶标序列、通用探针、靶标引物和pcr扩增试剂;
3、所述特异性介导探针由互补序列和突出序列组成;
4、所述突出序列位于所述特异性介导探针的5’端,且与靶标模板不互补;
5、所述特异性介导探针的3’末端连接有阻止序列延伸的基团;
6、所述辅助靶标序列由3’端序列、间隔序列和5’端序列组成;所述5’端序列与通用探针互补;所述间隔序列包括n个随机碱基,所述n为大于等于1的整数;所述3’端序列与介导引物互补,所述介导引物为所述特异性介导探针在扩增过程中被dna聚合酶酶解形成,所述介导引物由所述特异性介导探针的突出序列和1~2个互补序列上的靶标特异性碱基组成;
7、所述辅助靶标序列的3’末端连接m个连续碱基,5’末端连接k个连续碱基,所述m和k分别为大于等于2的整数。
8、优选的,所述互补序列的长度为15~35个碱基;所述突出序列的长度为5~25个碱基;所述阻止序列延伸的基团包括磷酸修饰基团、mgb修饰基团或与靶标模板不互补的短序列;所述与靶标模板不互补的短序列的长度为2个以上碱基。
9、优选的,所述5’端序列的长度为15~30个碱基;所述3’端序列的长度为5~25个碱基;所述间隔序列的长度为1个以上碱基。
10、优选的,所述介导引物中的1~2个靶标特异性碱基位于所述介导引物的3’端;所述介导引物不与任何已知物种的核苷酸序列互补。
11、优选的,所述通用探针的长度为15~30个碱基,所述通用探针的5’端修饰有发光基团,所述通用探针的3’端和/或中间位置分别修饰有猝灭基团。
12、优选的,所述靶标引物的上游引物的核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.7、seq id no.13、seq id no.20或seq id no.25所示;
13、所述靶标引物的下游引物的核苷酸序列如seq id no.2、seq id no.8、seq idno.14、seq id no.21或seq id no.26所示;
14、所述通用探针的核苷酸序列如seq id no.4或seq id no.10所示;
15、所述特异性介导探针的核苷酸序列如seq id no.5、seq id no.11、seq idno.16、seq id no.18、seq id no.23或seq id no.28所示;
16、所述辅助靶标序列的核苷酸序列如seq id no.6、seq id no.12、seq id no.17、seq id no.19、seq id no.24或seq id no.29所示。
17、优选的,所述通用数字pcr检测体系的核苷酸序列如组合1)~组合6)中的一种或多种所示:
18、所述组合1)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.4、seq id no.5和seq idno.6所示;
19、所述组合2)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.7、seq id no.8、seq id no.10、seq id no.11和seq idno.12所示;
20、所述组合3)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.13、seq id no.14、seq id no.10、seq id no.16和seq idno.17所示;
21、所述组合4)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.10、seq id no.18和seq idno.19所示;
22、所述组合5)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.20、seq id no.21、seq id no.10、seq id no.23和seq idno.24所示;
23、所述组合6)中的上游引物、下游引物、通用探针、特异性介导探针、辅助靶标序列的氨基酸序列分别如seq id no.25、seq id no.26、seq id no.10、seq id no.28和seq idno.29所示。
24、优选的,所述通用数字pcr检测体系中靶标引物的浓度为0.3~3μm,特异性介导探针的浓度为0.3~3μm,通用探针的浓度为0.3~3μm、辅助靶标序列的浓度为0.3~3μm。
25、本专利技术还提供了上述技术方案所述的通用数字pcr检测体系在基因的检测和/或定量中的应用。
26、优选的,所述基因的检测和/或定量的模板包括基因组dna、cdna、质粒dna或单链dna。
27、有益效果:
28、本专利技术提供了一种通用数字pcr检测体系,包括特异性介导探针、辅助靶标序列、通用探针、靶标引物和pcr扩增试剂;所述特异性介导探针由互补序列和突出序列组成;所述互补序列位于所述特异性介导探针的3’端,且与靶标模板互补;所述突出序列位于所述特异性介导探针的5’端,且与靶标模板不互补;所述特异性介导探针的3’末端连接有阻止序列延伸的基团;所述辅助靶标序列由3’端序列、间隔序列和5’端本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种通用数字PCR检测体系,包括特异性介导探针、辅助靶标序列、通用探针、靶标引物和PCR扩增试剂;
2.根据权利要求1所述的通用数字PCR检测体系,其特征在于,所述互补序列的长度为15~35个碱基;所述突出序列的长度为5~25个碱基;所述阻止序列延伸的基团包括磷酸修饰基团、MGB修饰基团或与靶标模板不互补的短序列;所述与靶标模板不互补的短序列的长度为2个以上碱基。
3.根据权利要求1所述的通用数字PCR检测体系,其特征在于,所述辅助靶标序列5’端序列的长度为15~30个碱基;所述3’端序列的长度为5~25个碱基;所述间隔序列的长度为1个以上碱基。
4.根据权利要求1或3所述的通用数字PCR检测体系,其特征在于,所述介导引物中的1~2个靶标特异性碱基位于所述介导引物的3’端;所述介导引物不与任何已知物种的核苷酸序列互补。
5.根据权利要求1所述的通用数字PCR检测体系,其特征在于,所述通用探针的长度为15~30个碱基,所述通用探针的5’端修饰有发光基团,所述通用探针的3’端和/或中间位置分别修饰有猝灭基团。
6.根据权
7.根据权利要求1所述的通用数字PCR检测体系,其特征在于,所述通用数字PCR检测体系的核苷酸序列如组合1)~组合6)中的一种或多种所示:
8.根据权利要求1所述的通用数字PCR检测体系,其特征在于,所述通用数字PCR检测体系中靶标引物的浓度为0.3~3μM,特异性介导探针的浓度为0.3~3μM,通用探针的浓度为0.3~3μM、辅助靶标序列的浓度为0.3~3μM。
9.权利要求1~8任一项所述的通用数字PCR检测体系在基因的检测和/或定量中的应用。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述基因的检测和/或定量的模板包括基因组DNA、cDNA、质粒DNA或单链DNA。
...【技术特征摘要】
1.一种通用数字pcr检测体系,包括特异性介导探针、辅助靶标序列、通用探针、靶标引物和pcr扩增试剂;
2.根据权利要求1所述的通用数字pcr检测体系,其特征在于,所述互补序列的长度为15~35个碱基;所述突出序列的长度为5~25个碱基;所述阻止序列延伸的基团包括磷酸修饰基团、mgb修饰基团或与靶标模板不互补的短序列;所述与靶标模板不互补的短序列的长度为2个以上碱基。
3.根据权利要求1所述的通用数字pcr检测体系,其特征在于,所述辅助靶标序列5’端序列的长度为15~30个碱基;所述3’端序列的长度为5~25个碱基;所述间隔序列的长度为1个以上碱基。
4.根据权利要求1或3所述的通用数字pcr检测体系,其特征在于,所述介导引物中的1~2个靶标特异性碱基位于所述介导引物的3’端;所述介导引物不与任何已知物种的核苷酸序列互补。
5.根据权利要求1所述的通用数字pcr检测体系,其特征在于,所述通用探针的长度为15~30个碱基,所述通用探针的5’端修饰有发光基团,所述...
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