【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种烟草干旱响应基因ntpmt2及其应用。
技术介绍
1、烟草是一种重要的叶用经济作物，水分是限制烟草生长发育和产质量形成的一个主要环境因子。近年来，我国许多烟区出现季节性干旱，导致烟叶产量和品质下降。因此，培育耐旱性强的烟草新品种，对减轻干旱影响具有重要意义。目前，挖掘关键功能基因，通过分子标记辅助选择或者基因编辑等分子育种手段改良新品种是一种有效且可行的途径。
2、干旱胁迫可导致植物体内活性氧(ros)积累，积累的ros主要有过氧化氢(h2o2)、超氧阴离子自由基(o2.-)、烷氧基自由基(ro)等，过量活性氧的积累导致膜脂过氧化，产生大量的丙二醛(mda)，mda与膜上的蛋白质发生反应，造成细胞膜损伤，使得膜通透性增大，发生离子渗漏。超氧化物歧化酶sod是ros清除系统中第一个发挥作用的关键抗氧化酶，它能及时清除活性氧和自由基，以提高植物对逆境的抗性。pod能通过将超氧化物转化为不活性物质，从而消除超氧化物对细胞的损害，过氧化物酶也能改善细胞信号以促进细胞对氧化损伤的修复。脯氨酸是植物在经历干旱胁迫过程中积累的一类重要的渗透调节物质。正常生长条件下，植物体内脯氨酸含量通常不高，但在经历干旱胁迫后，脯氨酸大量积累防止渗透胁迫对植物造成伤害。植物在受到胁迫时，叶面气孔导度会发生改变，影响叶内外气体交换、和植物蒸腾作用的强弱。蒸腾作用会影响到植株对土壤水分和无机盐的吸收以及植株体内水分转运。光合作用的强弱是决定植物干物质积累程度的基础，二氧化碳作为光合作用重要底物，其胞间浓度是光
3、s-腺苷-l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶(s-adenosyl-l-methionine-dependentmethyltransferases(sams))超家族有着接近57个拥有不同结构域的蛋白家族，在植物发育中发挥着重要作用。，它们催化蛋白质甲基化，而s-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine，sam)则是一种重要的中间代谢产物，可作为甲基供体、丙氨基供体及巯基化合物前体等参与体内众多生化反应，例如核酸、蛋白质、磷脂质和维生素等合成，也参与半胱氨酸、谷胱甘肽、多胺以及辅酶a和牛磺酸等含硫化合物的相互转化等。磷酸乙醇胺n-甲基转移酶pmt全名为s-腺苷甲硫氨酸:磷酸乙醇胺甲基转移酶,属于s-腺苷-l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶超家族。在植物中，磷酸乙醇胺甲基转移酶通过将丝氨酸来源的磷酸乙醇胺(phosphoethanolamine；pea)转化成磷酸单甲基乙醇胺(monomethyl ethanolaminephosphate；pmmea)再形成磷酸双甲基乙醇胺(dimethyl ethanolamine phosphate；pdmea)，最后生成合成磷脂酰胆碱的前体物质pcho，进而通过kennedy途径合成磷脂酰胆碱，又称卵磷脂(phosphatidyl choline；pc)。而磷脂酰胆碱是构成细胞膜的主要物质，磷脂酰胆碱在水解酶的作用下会生成一些代谢物，调节植物脱落酸信号及植物的抗逆性。有研究报道，敲除油菜中s-腺苷-l-蛋氨酸依赖的甲基转移酶基因bnpmt6后，敲除株系相对野生型含油量显著提升。
4、目前，关于烟草s-腺苷-l-蛋氨酸依赖性甲基转移酶基因在植物抗逆中的功能研究较少。前期基于干旱胁迫下对耐旱突变体的组学联合分析与共表达网络分析挖掘到一个响应干旱胁迫候选基因ntpmt2，在此基础上，本研究对该基因开展了功能鉴定及其调控机制解析，为烟草耐旱分子育种提供基因资源和理论基础。
技术实现思路
1、干旱是影响烟草生长发育和产质量形成的重要非生物胁迫之一，深入探究烟草耐旱调控机制、挖掘烟草耐旱基因，对选育耐旱新品种具有重要意义。本研究通过对前期筛选的耐旱突变体干旱胁迫下的转录组和代谢组联合分析，挖掘到一个受干旱胁迫诱导显著的候选基因ntpmt2，该基因cds序列长度为1842bp,编码具有613个氨基酸，编码一个s-腺苷-l-蛋氨酸依赖性甲基转移酶。以k326为背景，利用crispr/cas9技术获得两个该基因的敲除株系pmt2-21和pmt2-22。自然干旱结果表明，两个敲除株系经26d自然干旱处理、复水12d恢复情况明显强于野生型k326，其存活率显著提高；甘露醇模拟水分胁迫结果表明，在干旱胁迫下两个敲除株系萎蔫程度明显低于k326。生理生化结果显示，干旱胁迫下两个敲除株系pmt2-21和pmt2-22叶片中丙二醛(mda)、过氧化氢(h2o2)、超氧根阴离子(ofr)含量显著低于野生型；超氧化物歧化酶(sod)和过氧化物酶(pod)活性则显著高于野生型。光合指标结果显示，干旱胁迫下两个敲除株系的净光合速率、蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度和电子传递效率均显著高于野生型。综合以上结果证明ntpmt2负调控烟草耐旱性，敲除该基因可显著提高烟草耐旱性。该基因的发掘鉴定，对培育和鉴定烟草耐旱新品种提供了重要的基因资源和育种素材。
2、本专利技术的目的在于提供一种提高植物抗旱性的方法，本领域人员可通过已知的生物技术，例如转基因，基因编辑或者突变技术，使得植物中ntpmt2基因的表达降低或丧失，该植物即可具有提高的抗旱性。
3、具体而言，本专利技术提供一种用于构建干旱负调控基因ntpmt2的crsipr敲除载体的引物对，所述引物对为：
4、f1:cagtggtctcatgcagactcgtcatggtggccaag(seq id no.5)；
5、r1:cagtggtctcaaaactgtcatcctcgttacaccga(seq id no.6)，利用所述引物对在植物中敲除ntpmt2基因以提高植物的耐旱性。
6、本专利技术提供一种用于调控ntpmt2基因表达的载体，所述载体是利用所述的引物对f1/r1扩增ntpmt2基因(seq id no.17)或其cds序列(seq id no.11)，将获得的基因片段插入phsbdcas9i表达载体的bsai/eco31i酶切位点而得到，利用所述载体在植物中敲除ntpmt2基因以提高植物的耐旱性。
7、本专利技术提供分离的ntpmt2基因突变体pmt2-21，其核苷酸序列如seq id no.13所示，所述基因突变体pmt2-21使植物具有抗旱性，与野生型相比，pmt2-21(seq id no.13)在靶点2处缺失一个碱基。
8、本专利技术提供分离的ntpmt2基因突变体pmt2-21的编码蛋白，其氨基酸序列如seqid no.14所示，所述编码蛋白使植物具有抗旱性，与野生型相比，所述pmt2-21蛋白(seq idno.14)翻译提前终止。
9、本专利技术提供分离的ntpmt2基因突变体pmt2-22，本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种引物对，其特征在于，所述引物对为：
2. 一种用于调控NtPMT2基因表达的载体，其特征在于，所述载体是利用权利要求1所述的引物对扩增NtPMT2基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示、或其CDS序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，将获得的基因片段插入pHSbdcas9i表达载体的BsaI/Eco31I酶切位点而得到。
3.分离的NtPMT2基因突变体pmt2-21，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
4.分离的NtPMT2基因突变体pmt2-21的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
5.分离的NtPMT2基因突变体pmt2-22，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
6.分离的NtPMT2基因突变体pmt2-22的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示。
7.干旱负调控基因NtPMT2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示、或其CDS序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示、靶点1，核苷酸序列如SEQ ID NO.1
8.一种耐旱植物的育种方法，其特征在于，所述方法包括将NtPMT2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示、或其CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示、靶点1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示、和/或靶点2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示、权利要求1所述的引物对、或权利要求2所述的载体用于所述方法，在植物中敲除NtPMT2基因或其同源基因NSPMT2、NtoPMT2、NaPMT2、SsPMT2 isoform Xl、SvPMT2_isoform X1、StPMT2，或SdPMT2以获得耐旱性提高的植物，或着，将权利要求3和/或5所述的NtPMT2基因突变体在植物中过表达，以获得耐旱性提高的植物，和/或将上述已获得的耐旱性提高的植物与其他植物品种杂交产生植物后代、以及回交或自交产生植物后代，使得SEQ ID NO.14和/或SEQ ID NO.16所示的氨基酸突变在植物中表达，从而获得耐旱性提高的植物，其中，所述敲除包括缺失或抑制NtPMT2基因表达，所述植物包括单子叶植物、双子叶植物，所述植物优选为烟草。
9.一种相对于野生型植株降低植物叶片中丙二醛、过氧化氢、和/或超氧根阴离子含量，和/或提高超氧化物歧化酶和/或过氧化物酶活性；和/或提高净光合速率、蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度和电子传递效率的方法，其特征在于，所述方法包括将NtPMT2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示、或其CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示、靶点1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示和/或靶点2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示、权利要求1所述的引物对、或权利要求2所述的载体用于所述方法，在植物中敲除NtPMT2基因或其同源基因NSPMT2、NtoPMT2、NaPMT2、SsPMT2 isoform Xl、SvPMT2_isoform X1、StPMT2、或SdPMT2以提高植物耐旱性，或着，将权利要求3和/或5所述的基因突变体在植物中过表达，以提高植物耐旱性，并同时进行干旱诱导，其中，所述敲除包括缺失或抑制NtPMT2基因表达，所述植物包括单子叶植物、双子叶植物，所述植物优选烟草。
10.一种鉴定植物是否为NtPMT2基因敲除植物的方法，其特征在于，如果待检测植株中检测到NtPMT2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示、其CDS序列，其核苷酸序列如SEQID NO.11所示、和/或其编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示则为NtPMT2基因未...
【技术特征摘要】
1.一种引物对，其特征在于，所述引物对为：
2. 一种用于调控ntpmt2基因表达的载体，其特征在于，所述载体是利用权利要求1所述的引物对扩增ntpmt2基因，核苷酸序列如seq id no.17所示、或其cds序列，核苷酸序列如seq id no.11所示，将获得的基因片段插入phsbdcas9i表达载体的bsai/eco31i酶切位点而得到。
3.分离的ntpmt2基因突变体pmt2-21，其核苷酸序列如seq id no.13所示。
4.分离的ntpmt2基因突变体pmt2-21的编码蛋白，其氨基酸序列如seq id no.14所示。
5.分离的ntpmt2基因突变体pmt2-22，其核苷酸序列如seq id no.15所示。
6.分离的ntpmt2基因突变体pmt2-22的编码蛋白，其氨基酸序列如seq id no.16所示。
7.干旱负调控基因ntpmt2，其核苷酸序列如seq id no.17所示、或其cds序列，核苷酸序列如seq id no.11所示、靶点1，核苷酸序列如seq id no.18所示，和/或靶点2，核苷酸序列如seq id no.19所示、权利要求1所述的引物对、权利要求2所述的载体、权利要求3或5所述的ntpmt2基因突变体在影响植物耐旱性育种中的应用，其特征在于，在植物中敲除ntpmt2基因或其同源基因nspmt2、ntopmt2、napmt2、sspmt2 isoform xl、svpmt2_isoformx1、stpmt2、或sdpmt2以获得耐旱性提高的植物，或在植物中过表达所述突变体基因的任一种或两种以获得耐旱性提高的植物，和/或将上述获得的耐旱性提高的植物与其他植物品种杂交产生植物后代、以及回交或自交产生植物后代，使得seq id no.14和/或seq idno.16所示的氨基酸突变在植物中表达，从而获得耐旱性提高的植物，其中，所述敲除包括缺失或抑制ntpmt2基因表达，所述植物包括单子叶植物、双子叶植物，所述植物优选为烟草。
8.一种耐旱植物的育种方法，其特征在于，所述方法包括将ntpmt2基因，其核苷酸序列如seq id no.17所示、或其cds序列，其核苷酸序列如seq id no.11所示、靶点1，其核苷酸序列如seq id no.18所示、和/或靶点2，其核苷酸序列如seq id no.19所示、权利要求1所述的引物对、或权利要求2所述的载体用于所述方法，在植物中敲除ntpmt2基因或其同源基因nspmt2、ntopmt2、napmt2、sspmt2 ...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡日生，户正荣，姜习振，唐浩存，李洋洋，任晓敏，向世鹏，刘天波，伍绍龙，杨晨凯，易鹏飞，晏伟杰，李泽明，
申请(专利权)人：中国烟草总公司湖南省公司，
类型：发明
国别省市：
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