【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及属于微生物基因工程及生物工程，更具体地，涉及一种产硫化氢工程菌、构建方法及应用。
技术介绍
1、由于工业的发展和社会化城市进程的加快，许多含有重金属污染的废气、废水、废渣通过各种途径释放到环境中，导致环境中重金属污染问题十分严峻。这些重金属通过生物富集作用进入食物链，对人体、动植物以及微生物造成危害，特别是进入人体后，会诱发癌变或相关疾病的发生，对人类健康造成严重的威胁，因此，重金属污染修复已成为生态环境保护的重要内容。
2、传统的重金属污染修复方法主要为物理修复和化学修复，但是物理化学修复存在着诸多问题，如离子交换方法成本高昂，化学沉淀方法具有成本优势但是容易产生大量的污泥。而使用生物修复方法治理环境污染，更廉价且环境友好。生物修复主要包括植物修复、动物修复和微生物修复。植物修复能够通过自身的吸附富集重金属从而减少重金属污染。但植物修复仍然面临着许多问题与挑战，如植物生长周期长，修复过程较为缓慢；植物的生长受到环境的限制；植物难以处理与土壤中的有机质紧密结合的重金属。在动物修复中，常使用蚯蚓进行重金属的转化，但蚯蚓的活动范围十分有限，大规模使用受到限制。因此，迫切需要一种替代的、可持续的技术进行重金属污染修复。
3、与动植物修复技术相比，微生物修复技术具有高效、成本较低，对环境扰动小，无二次污染等优点，成为重金属污染修复研究的热点，越来越多的微生物菌株被开发出来用于重金属污染物的处理。但由于多数自然菌株对重金属的处理效率较低，且因菌株的特性各异对应用环境的适应性不强，目前尚未报道效果特别理
技术实现思路
1、针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供了一种产硫化氢的工程菌、构建方法及应用。本专利技术以具有广泛环境适应性的解脂耶氏酵母为宿主，通过基因敲除技术改造其内源硫代谢途径，使met25基因和yali0f14047g基因失活，丧失原本的功能，构建解脂耶氏酵母的met25基因和yali0f14047g基因突变体，从而使h2s的代谢途径受到抑制，最终积累大量的硫化氢。将此工程菌作为去除重金属的生物修复平台，以解决现有技术中微生物修复重金属污染处理效率较低，且因菌株的特性各异对应用环境的适应性不强的技术问题。
2、根据本专利技术第一方面，提供了一种产硫化氢的工程菌的构建方法，包括以下步骤：
3、(1)将特异性靶向解脂耶氏酵母met25基因的引导rna与基因敲除载体pcrispryl相连，得到第一重组质粒pcrispryl-met25-sgrna；所述特异性靶向解脂耶氏酵母met25基因的序列如seq id no：1所示；
4、(2)将步骤(1)得到的第一重组质粒转化进入解脂耶氏酵母感受态细胞，得到met25基因突变菌株，其中突变的met25基因的序列如seq id no：2所示；
5、(3)将特异性靶向解脂耶氏酵母yali0f14047g基因的引导rna与基因敲除载体pcrispryl相连，所述特异性靶向解脂耶氏酵母yali0f14047g基因的序列如seq id no：3所示，得到第二重组质粒pcrispryl-yali0f14047g-sgrna；然后将该第二重组质粒转化进入步骤(2)所述的met25基因突变菌株中，得到met25基因和yali0f14047g基因突变菌株，其中突变的yali0f14047g基因的序列如seq id no：4所示，即得到所述产硫化氢的工程菌。
6、优选地，所述特异性靶向解脂耶氏酵母met25基因的引导rna的碱基如seq id no：5所示。
7、优选地，所述特异性靶向解脂耶氏酵母yali0f14047g基因的引导rna的碱基如seqid no：6所示。
8、根据本专利技术另一方面，提供了任意一项方法构建得到的产硫化氢的工程菌。
9、根据本专利技术另一方面，提供了所述的产硫化氢的工程菌用于矿化重金属离子的应用。
10、优选地，所述应用具体为：将所述工程菌加入含有重金属离子的培养基中，进行培养，所述工程菌培养的过程中会产生硫化氢气体，所述硫化氢气体与重金属离子反应生成硫化物沉淀，即完成重金属离子的矿化。
11、优选地，所述重金属离子为铅离子、铜离子、汞离子和镉离子中的至少一种。
12、总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
13、(1)本专利技术中以解脂耶氏酵母为底盘细胞，利用crispr-cas9技术，改造内源硫代谢途径，工程菌在突变两个基因之后使解脂耶氏酵母h2s的代谢途径受到抑制，最终积累大量的硫化氢，产量可达560ppm，赋予原本几乎不产硫化氢气体的菌株产生硫化氢的能力。
14、(2)本专利技术将高产h2s工程菌应用于重金属污染修复领域，在处理12h后，工程菌对cd2+、cu2+、pb2+的去除率可达到90％以上，对hg2+的去除率可达40％。因此，本专利技术菌株在重金属环境污染治理领域具有良好的工业化应用前景。
15、(3)本专利技术通过基因敲除技术改造解脂耶氏酵母的内源硫代谢途径，使其高产硫化氢，将具有广泛环境适应性的解脂耶氏酵母转化为去除重金属的生物修复平台，重金属离子与硫化氢反应矿化成难溶的矿物质，脱离环境生态系统的物质循环，以彻底解决重金属污染，建立科学、高效、可行的重金属污染生物修复方法，对实现重金属污染的持久性污染治理具有重要的意义。
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1.一种产硫化氢的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的产硫化氢的工程菌的构建方法，其特征在于，所述特异性靶向解脂耶氏酵母Met25基因的引导RNA的碱基如SEQ ID NO：5所示。
3.如权利要求1所述的产硫化氢的工程菌的构建方法，其特征在于，所述特异性靶向解脂耶氏酵母YALI0F14047g基因的引导RNA的碱基如SEQ ID NO：6所示。
4.如权利要求1-3任意一项方法构建得到的产硫化氢的工程菌。
5.如权利要求4所述的产硫化氢的工程菌用于矿化重金属离子的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：将所述工程菌加入含有重金属离子的培养基中，进行培养，所述工程菌培养的过程中会产生硫化氢气体，所述硫化氢气体与重金属离子反应生成硫化物沉淀，即完成重金属离子的矿化。
7.如权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述重金属离子为铅离子、铜离子、汞离子和镉离子中的至少一种。
【技术特征摘要】
1.一种产硫化氢的工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的产硫化氢的工程菌的构建方法，其特征在于，所述特异性靶向解脂耶氏酵母met25基因的引导rna的碱基如seq id no：5所示。
3.如权利要求1所述的产硫化氢的工程菌的构建方法，其特征在于，所述特异性靶向解脂耶氏酵母yali0f14047g基因的引导rna的碱基如seq id no：6所示。
4.如权利要求1-3任意一项方法构建...
【专利技术属性】
技术研发人员：闫云君，杨凯欣，杨敏，解晓慢，李欢欢，张浩然，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：
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