【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程和酶工程领域，具体涉及一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白随机突变体库及应用。
技术介绍
1、纤维小体是在厌氧微生物中发现的一种天然的多酶复合物，主要由两部分组成：含有酶或其他辅助蛋白的对接蛋白dockerin(doc)，具有催化作用；含有结构蛋白的黏连蛋白cohesin(coh)，也被称为脚手架蛋白scaffoldin(sca)、支架蛋白cellulose integratedproteina(cipa)，具有组装作用，参见文献[wang,international journal molecularsciences，2019，20：13；hirano,scientific reports，2016，6：35709]。该纤维小体的每种酶具有单个doc模块和至少一个非酶支架组分。
2、热纤梭菌c.thermocellum中的纤维小体是研究最广泛和最典型的纤维小体模型，它的形成是由两种特定的相互作用介导的：一种相互作用是在纤维小体c端ⅰ型对接蛋白doc模块和主要支架蛋白cipa内部的9个ⅰ型黏连蛋白coh模块之间的相互作用；另一种相互作用是在cipa的c端细胞表面显示未结合的二级支架蛋白的内部ⅱ型coh模块与ⅱ型对接蛋白doc模块之间的相互作用。主要由三部分组成：含酶i型doc蛋白、一级支架蛋白和锚定支架蛋白，参见文献[fontes,annual review of biochemistry，2010，79：655-681]。纤维小体作为一种天然高效的多酶自组装系统，已成功地展示在细菌、酵母和其他
3、现有技术发现对于厌氧菌而言，ca2+对doca蛋白的结构稳定性和功能完整性起着重要作用。现有研究发现，厌氧菌的doca在与edta螯合ca2+后，不再与coh相互作用，参见文献[betsy,archives of biochemietry and biophysics，2000，379：237-244]。现有技术中细胞外doca和coh相互作用以实现高效的自组装需要一定浓度ca2+的存在，参见文献[bule,journal of biological chemistry，2018，293：4201-4212；xu,biotechnology forbiofuels，2013，6：126]。但由于ca2+通道等成分的严格控制，微生物细胞内静态ca2+浓度一般仅为1.00×10-7mol/l，远低于胞外浓度(1.00×10-3mol/l)，这限制了doca和coh在细胞内的相互作用和自组装。
4、现有技术无法提供能够在10-7m～10-6m条件下能够有效组装的纤维小体元件，也无法提供在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10-7m～2mm)中都能发挥作用的纤维小体元件，更无法提供能够在生物细胞内(钙离子浓度≤10-6m)组装的纤维小体元件。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白随机突变体库及应用。
2、专利技术人发现将对接蛋白doca中d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45的8个位点随机突变，可以改变来自于不同产生物种的doc和coh在细胞内相互之间的亲和能力。
3、本专利技术提供的突变体，解决了现有纤维小体元件在低钙离子浓度下(如细胞内)无法自组装的问题，提供了一种在宽范围钙离子环境(钙离子浓度10-7m～2×10-3m)发挥作用的纤维小体对接蛋白突变体库。
4、上述d为天冬氨酸，n为天冬酰胺，t为苏氨酸，s为丝氨酸，f为苯丙氨酸，v为缬氨酸，r为精氨酸，y为酪氨酸；数字代表该位点处于该序列中的第几位。
5、本专利技术涉及的技术方案如下：
6、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白随机突变体库，所述突变体库为在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为在d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45的8个位点随机突变，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。
7、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m62，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为f5、r7、v9、f11、f39、y41、f43和y45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。
8、上述对接蛋白突变体doca-m62的编码基因，所述编码基因为根据上述对接蛋白doca氨基酸的突变位点在对接蛋白doca的核苷酸序列上进行定点突变后的基因，所述对接蛋白doca的核苷酸序列的如seq id no.1所示。
9、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m51，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为s5、n7、f9、c11、y39、h41、y43和k45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。
10、上述对接蛋白突变体doca-m51的编码基因，所述编码基因为根据上述对接蛋白doca氨基酸的突变位点在对接蛋白doca的核苷酸序列上进行定点突变后的基因，所述对接蛋白doca的核苷酸序列的如seq id no.1所示。
11、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m53，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为p5、i7、g9、r11、r39、l41、m43和r45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。
12、上述对接蛋白突变体doca-m53的编码基因，所述编码基因为根据上述对接蛋白doca氨基酸的突变位点在对接蛋白doca的核苷酸序列上进行定点突变后的基因，所述对接蛋白doca的核苷酸序列的如seq id no.1所示。
13、一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m61，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为t5、k7、i9、y11、n39、l41、y43和f45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白随机突变体库，其特征在于，所述突变体库为在对接蛋白DocA的氨基酸序列上进行突变，突变位点为在D5、N7、D9、T11、D39、D41、N43和S45的8个位点随机突变，所述对接蛋白DocA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体DocA-M62，其特征在于，在对接蛋白DocA的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将D5、N7、D9、T11、D39、D41、N43和S45突变为F5、R7、V9、F11、F39、Y41、F43和Y45，所述对接蛋白DocA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求2所述对接蛋白突变体DocA-M62的编码基因，其特征在于，所述编码基因为根据上述对接蛋白DocA氨基酸的突变位点在对接蛋白DocA的核苷酸序列上进行定点突变后的基因，所述对接蛋白DocA的核苷酸序列的如SEQ ID NO.1所示。
4.一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体DocA-M51，其特征在于，在对接蛋白DocA的氨基酸序列上进行突变，突变位
5.一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体DocA-M53，其特征在于，在对接蛋白DocA的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将D5、N7、D9、T11、D39、D41、N43和S45突变为P5、I7、G9、R11、R39、L41、M43和R45，所述对接蛋白DocA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
6.一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体DocA-M61，其特征在于，在对接蛋白DocA的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将D5、N7、D9、T11、D39、D41、N43和S45突变为T5、K7、I9、Y11、N39、L41、Y43和F45，所述对接蛋白DocA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
7.一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体DocA-M65，其特征在于，在对接蛋白DocA的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将D5、N7、D9、T11、D39、D41、N43和S45突变为Y5、S7、I9、S11、F39、N41、V43和V45，所述对接蛋白DocA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
8.一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体DocA-M66，其特征在于，在对接蛋白DocA的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将D5、N7、D9、T11、D39、D41、N43和S45突变为F5、S7、Y9、F11、I39、L41、R43和R45，所述对接蛋白DocA的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
9.权利要求2-8任一项所述纤维小体对接蛋白突变体在与黏连蛋白相互作用构建蛋白复合体中的应用，所述黏连蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
10.如权利要求9所述应用，其特征在于，所述对接蛋白突变体与黏连蛋白在10-7M～10-6M钙离子浓度下相互作用构建蛋白复合体中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白随机突变体库，其特征在于，所述突变体库为在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为在d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45的8个位点随机突变，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。
2.一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m62，其特征在于，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为f5、r7、v9、f11、f39、y41、f43和y45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示。
3.权利要求2所述对接蛋白突变体doca-m62的编码基因，其特征在于，所述编码基因为根据上述对接蛋白doca氨基酸的突变位点在对接蛋白doca的核苷酸序列上进行定点突变后的基因，所述对接蛋白doca的核苷酸序列的如seq id no.1所示。
4.一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m51，其特征在于，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为s5、n7、f9、c11、y39、h41、y43和k45，所述对接蛋白doca的氨基酸序列如seq id no.2所示；
5.一种适用于纤维小体胞内自组装对接蛋白突变体doca-m53，其特征在于，在对接蛋白doca的氨基酸序列上进行突变，突变位点为将d5、n7、d9、t11、d39、d41、n43和s45突变为p5、i7、...
【专利技术属性】
技术研发人员：李楠，杨露，徐子婷，容文，邓攀，刘月涵，赵亚琪，孙初颖，汪俊卿，李丕武，王瑞明，王婷，苏静，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学山东省科学院，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。