【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，尤其涉及一种与甘蓝型油菜黑胫病基因bnrlm1紧密连锁的snp分子标记、kasp标记引物、试剂盒及其应用。
技术介绍
1、油菜各生育期均可感染黑胫病，病部形成灰白色枯斑，斑内散生黑色小点。病斑蔓延至茎基部及根系，引起须根腐朽，根颈易折断。成株期叶上病斑圆形或不规则形，稍凹陷，中部灰白色。茎、根上病斑初呈灰白色、长椭圆形，逐渐枯朽，上生黑色小点，植株易折断死亡。角果上的病斑多从角尖开始，与茎上病斑相似；种子感病后变白皱缩，失去光泽。由斑点小球腔菌(l.maculans)引起的症状常见于茎基部，而双球小球腔菌(l.biglobosa)引起的症状常局限于茎基以上茎秆。
2、选用抗(耐)病品种抗病品种在许多国家已经成功应用于油菜黑胫病的防治，但对于双球小球腔菌(l.biglobosa)的抗性研究甚少。此外，一些研究表明，对斑点小球腔菌(l.maculans)的抗性基因对双球小球腔菌(l.biglobosa)并没有效果。我国很多油菜品种对国外的强毒病原斑点小球腔菌(l.maculans)引起的黑胫病均表现感病，可见黑胫病始终是我国油菜生产上的威胁，培育和选用抗病品种可防患于未然，避免黑胫病对我国油菜造成毁灭性为害。
3、为揭示油菜控制黑胫病抗病的分子生物学机制，挖掘、开发和利用其重要农业价值和观赏价值，开发基于kasp技术的黑胫病基因bnrlm1的功能连锁snp标记可以作为一种高效的鉴定标记，支持在油菜育种过程中高通量、低成本、高精确度的鉴定功能基因的情况，从而加速油菜的育种选择，在本
具
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是，克服以上
技术介绍
中提到的不足和缺陷，提供一种与甘蓝型油菜黑胫病基因bnrlm1紧密连锁的snp分子标记、kasp标记引物、试剂盒及其应用，能够快速、高通量、低成本实现黑胫病基因bnrlm1的基因突变型进行鉴定。
2、为解决上述技术问题，本专利技术提出的技术方案为：
3、一种与甘蓝型油菜黑胫病基因bnrlm1紧密连锁的snp分子标记，以甘蓝型油菜的darmor-bzh基因组版本为参考，所述snp分子标记在甘蓝型油菜a07染色体上的第19986961位碱基存在多态性，其多态性为t或c。
4、上述的应用，优选的，所述应用为鉴定甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型；鉴定所述甘蓝型油菜a07染色体上的第19986961位碱基为纯合t时，甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型为感病；鉴定所述甘蓝型油菜a07染色体上的第19986961位碱基为纯合c或t/c时，甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型为抗病。
5、优选的，所述鉴定甘蓝型油菜黑胫病抗性表型采用的kasp标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
6、特异性引物x：gagcgtttctctgcgcactt(如seq id no:1所示)；
7、特异性引物y：agcgtttctctgcgcactc(如seq id no:2所示)；
8、通用引物c：ataggagaaagagcctcggaagaa(如seq id no:3所示)。
9、优选的，所述应用的方法包括以下步骤：
10、(1)提取甘蓝型油菜待测样品的总dna；
11、(2)以步骤(1)提取的dna为模板，分别利用所述的kasp标记引物进行pcr扩增，然后进行荧光信号扫描、基因型分型；如果样品中只检测到特异性引物x的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因x；如果只检测到特异性引物y的荧光，则该样品的基因型为纯合等位基因y；如果同时检测到特异性引物x和y荧光，则该样品的基因型为杂合；
12、(3)根据基因型分型结果进行数据分析，得出甘蓝型油菜待测样品的黑胫病基因bnrlm1分型。
13、优选的，所述方法采用douglas array tape平台进行；pcr扩增体系包括：100μm通用引物c、100μm特异性引物x、100μm特异性引物y、2×kasp master mix、甘蓝型油菜待测样品的dna、超纯水。
14、优选的，用soellex进行pcr扩增，扩增条件如下：94℃15分钟；94℃20秒，65℃-57℃60秒，10个循环；94℃20秒，57℃60秒，33个循环。
15、基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因bnrlm1的kasp标记引物，所述kasp标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
16、特异性引物x：gagcgtttctctgcgcactt(如seq id no:1所示)；
17、特异性引物y：agcgtttctctgcgcactc(如seq id no:2所示)；
18、通用引物c：ataggagaaagagcctcggaagaa(如seq id no:3所示)。
19、基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因bnrlm1的试剂盒，包含上述的kasp标记引物。
20、上述的试剂盒，优选的，所述特异性引物x、特异性引物y、通用引物c在pcr反应体系中浓度之比为10～12:10～12:25～30。
21、优选的，所述试剂盒中还包含2×kasp master mix和超纯水。
22、基于一个总的专利技术构思，本专利技术还提供一种所述kasp标记引物或所述试剂盒在鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因bnrlm1中的应用。
23、与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
24、(1)本专利技术筛选出一个与甘蓝型油菜黑胫病基因bnrlm1紧密连锁的snp分子标记及其kasp标记引物组和试剂盒，用于黑胫病基因bnrlm1突变型的精准鉴定，这个标记分型质量高、单拷贝、高多态性(在现有甘蓝型油菜资源中的pic值高于>0.3)，样本数据检出率>98％，可用于甘蓝型油菜的花期育种改良的标记辅助育种，具有广泛的应用普适性。
25、(2)本专利技术还提供了上述kasp标记引物和试剂盒鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因bnrlm1的应用方法，该检测方法简单、自动化程度高达90％；检测通量高、速度快(8小时可获得122,880个数据点，是传统的96孔板snp基因分型方法的10倍)；检测反试剂用量少(仅0.8ul/反应)，试剂耗材成本低(与传统的96孔板snp基因分型方法相比，试剂耗材成本降低70％-90％)；检测结果准确、重复性和稳定性好，不同检测实验室的数据结果可以相互比较验证，数据具有普适的可比性；本专利技术提供了一种快速、高效、低成本、精准检测的普适性方法。
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1.一种与甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1紧密连锁的SNP分子标记，其特征在于，以甘蓝型油菜的Darmor-bzh基因组版本为参考，所述SNP分子标记在甘蓝型油菜A07染色体上的第19986961位碱基存在多态性，其多态性为T或C。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为鉴定甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型；鉴定所述甘蓝型油菜A07染色体上的第19986961位碱基为纯合T时，甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型为感病；鉴定所述甘蓝型油菜A07染色体上的第19986961位碱基为纯合C或T/C时，甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型为抗病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴定甘蓝型油菜黑胫病抗性表型采用的KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述方法采用Douglas Array Tape平台进行；PCR扩增体系包括：100μM通用引物C、100μM特异性引物X、100μM特异性引物Y、2×KASP
6.一种鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1的KASP标记引物，其特征在于，所述KASP标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
7.一种鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求6所述的KASP标记引物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物X、特异性引物Y、通用引物C在PCR反应体系中浓度之比为10～12:10～12:25～30。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含2×KASP MasterMix和超纯水。
10.一种如权利要求6所述的KASP标记引物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒在鉴定甘蓝型油菜黑胫病基因BnRlm1中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种与甘蓝型油菜黑胫病基因bnrlm1紧密连锁的snp分子标记，其特征在于，以甘蓝型油菜的darmor-bzh基因组版本为参考，所述snp分子标记在甘蓝型油菜a07染色体上的第19986961位碱基存在多态性，其多态性为t或c。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为鉴定甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型；鉴定所述甘蓝型油菜a07染色体上的第19986961位碱基为纯合t时，甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型为感病；鉴定所述甘蓝型油菜a07染色体上的第19986961位碱基为纯合c或t/c时，甘蓝型油菜的黑胫病抗性表型为抗病。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鉴定甘蓝型油菜黑胫病抗性表型采用的kasp标记引物的核苷酸序列由5'端至3'端如下所示：
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述方法采用douglas array...
【专利技术属性】
技术研发人员：李乐，贾佩陇，郭铭凯，唐宜，聂超南，唐顺学，
申请(专利权)人：华智生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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