【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种尿酸酶变体以及一种尿酸酶的纯化方法。
技术介绍
1、尿酸是生物体内嘌咛代谢的终极产物，能被尿酸酶降解为尿囊素、二氧化碳和过氧化氢。尿酸是难溶性物质，只有少量尿酸随着尿液和粪便被排出体外，大部分尿酸仍储存在人体内，正常人体内尿酸生成和排泄速度基本恒定。随着生活水平的提高，人们的生活方式发生了很大的改变，人体摄入嘌呤的含量不断的增加，导致产生的尿酸含量不断增加。然而人体排泄尿酸的量却无法随之增加，因此大量的尿酸堆积在人体内，导致痛风等疾病的发病率不断增加。尿酸酶可以降解尿酸，能有效降低人体内的尿酸浓度。但是尿酸酶在人体内的半衰期比较短，患者需要长时间、定期注射外源尿酸酶，因此尿酸的需求量不断增大。选择利用微生物发酵生产是获得大量尿酸酶的最佳方法，然而用该方法获得的尿酸酶中存在许多杂质，需要纯化后才可用于疾病的治疗。
2、目前，现有技术中有多种方式对尿酸酶进行纯化，cn201410015218.4中公开了一种天然哺乳动物尿酸酶制备方法，其通过先对哺乳动物肝脏仅匀质破碎处理，之后用ph8.2的缓冲液进行洗涤，用ph 10.2的缓冲液溶解洗涤沉淀，得尿酸酶初提液；初提液用硫酸铵分级沉淀，复溶缓冲液溶解，复溶液进行阴离子交换层析(阴离子交换层析纯化介质为偶联二乙基(2-羟丙基)氨基乙基或二乙氨基乙基基团的琼脂糖系列离子交换介质)纯化，得尿酸酶粗纯品溶液；将上述尿酸酶粗纯品溶液进行亲和层析纯化，得尿酸酶纯品溶液。该方法用于哺乳动物尿酸酶纯化，仅进行了硫酸铵分级沉淀和亲和层析，酶活损失较大；亲和层析后未进行处理，需
3、也有采用多重纯化方式，例如选用聚乙烯亚胺、硫酸铵盐析、阴离子交换层析、阳离子交换层析、层析脱盐、冷冻干燥的纯化方法。但纯化过程完全忽视了酶液残留的盐对阴离子交换层析和阳离子交换层析的影响,这会导致纯化过程的效果变差。并且同时进行了阴离子交换层析和阳离子交换层析，对纯化效果的提升不大，但是却增加了尿酸酶的损失量。
4、目前已有多种人源尿酸酶出现，例如，cn201510555258.2公开了一种重组人/狒狒嵌合尿酸酶蛋白，其通过将人与狒狒嵌合尿酸酶实现对痛风的治疗，但其活性仍有改善空间。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本专利技术提出了一种尿酸酶变体以及新的纯化方法，本专利技术所公开的尿酸酶变体相对于野生型尿酸酶，酶活更高，且稳定性更好；本专利技术所公开的尿酸酶纯化方法，能够实现更高效率、更优效果的纯化。
2、在本专利技术的一个方面，提供了一种尿酸酶变体，所述变体相对于氨基酸序列为seqid no.1的野生型尿酸酶具有至少80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或100％同一性的氨基酸序列
3、在一些具体实施方式中，所述尿酸酶变体相对于氨基酸序列为seq id no.1的野生型尿酸酶至少具有以下一个或多个位置的突变：l181和/或p182。
4、在一些实施方式中，所述变体相对于氨基酸序列为seq id no.1的野生型尿酸酶变体，至少有以下一个或多个位置的突变：l181s和/或p182k。
5、在本专利技术的一个方面，提供了一种核苷酸，其编码如前所述的尿酸酶变体。
6、在一些实施方式中，所述核苷酸密码子优化以在原核生物中表达。
7、在一些实施方式中，所述核苷酸密码子优化以在大肠杆菌中表达。
8、在本专利技术的一个方面，提供了一种载体，所述载体包含前述的核苷酸。
9、在一些实施方式中，所述核苷酸可操作地连接至启动子。
10、在一些实施方式中，所述启动子是组成型启动子、诱导性启动子、泛在性启动子、细胞类型特异性启动子或组织特异性启动子。
11、在本专利技术的一个方面，提供了一种细胞，其包含前述的尿酸酶变体、核苷酸或载体。
12、在一些实施方式中，所述的细胞为原核细胞。
13、在一些实施方式中，所述的细胞为大肠杆菌。
14、在本专利技术的一个方面，提供了一种尿酸酶变体的纯化方法，其步骤如下：
15、(1)硫酸铵分级沉淀
16、将经过简单过滤处理后含尿酸酶的发酵液置于冰水中，缓慢加入硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵的浓度达到20％-40％；冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液；然后向上清液中缓慢加入硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵的浓度达到70％-90％；冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀；再用1-100mm、ph5.0-8.0的pbs缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存；
17、(2)透析
18、将步骤(1)所得的酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1-100mm、ph 5.0-8.0的pbs缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
19、(3)deae纤维素层析
20、deae纤维素层析柱用1-100mm、ph 5.0-8.0的pbs缓冲液平衡后，将步骤(2)所得的酶液上样，再用该pbs缓冲液平衡，然后用含0.5m nacl、ph 5.0-8.0的1-100mm pbs缓冲液洗脱，收集洗脱样品；
21、(4)第二次透析
22、将步骤(3)所得的酶液酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于1-100mm、ph5.0-8.0的pbs缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
23、(5)超滤浓缩
24、对步骤(4)所得的酶液进行膜过滤；
25、(6)冻干
26、将步骤(5)所得的酶液置于-80℃冰箱中冷冻过夜，然后冻干，得到尿酸酶酶粉。
27、在一些具体实施方式中，所述纯化方法步骤如下：
28、(1)硫酸铵分级沉淀
29、将经过简单过滤处理后含尿酸酶的100ml发酵液置于冰水中，缓慢加入16.4g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解,使硫酸铵的浓度达到30％；冰水浴3h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留上清液；然后向上清液中缓慢加入34.8g硫酸铵，并不断搅拌，直至硫酸铵完全溶解，使硫酸铵的浓度达到80％；冰水浴24h，在4℃、12000r/min的条件下离心15min，保留沉淀；再用20ml 10mm、ph 8.0的pbs缓冲液溶解沉淀，于2-8℃的冰箱中保存；
30、(2)透析
31、将步骤(1)所得酶液置于透析袋中，封口，再将透析袋置于10mm、ph 8.0的pbs缓冲液中，透析24h，每隔4h换一次透析液；
32、(3)deae纤维素层析
33、deae纤维素层析柱用10mm、ph 8.0的pbs缓冲液平衡后，用步骤(2)所得酶液上样，再用该pbs缓冲液本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种尿酸酶变体，所述变体相对于氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型尿酸酶变体，至少有以下一个或多个位置的突变：L181和/或P182。
2.如权利要求1所述的尿酸酶变体，所述变体相对于氨基酸序列为SEQ ID NO.1的野生型尿酸酶变体，至少有以下一个或多个位置的突变：L181S和/或P182K。
3.一种核苷酸，其编码如权利要求1或2所述的尿酸酶变体。
4.一种载体，所述载体包含权利要求3所述的核苷酸。
5.一种细胞，其包含权利要求1-2任一项所述的尿酸酶变体、权利要求3所述的核苷酸或权利要求4所述的载体。
6.一种尿酸酶变体的纯化方法，其步骤如下：
7.如权利要求6所述的纯化方法，其步骤如下：
8.如权利要求6所述的纯化方法，其步骤如下：
9.如权利要求6所述的纯化方法，其步骤如下：
10.如权利要求1或2所述的尿酸酶变体在制备药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种尿酸酶变体，所述变体相对于氨基酸序列为seq id no.1的野生型尿酸酶变体，至少有以下一个或多个位置的突变：l181和/或p182。
2.如权利要求1所述的尿酸酶变体，所述变体相对于氨基酸序列为seq id no.1的野生型尿酸酶变体，至少有以下一个或多个位置的突变：l181s和/或p182k。
3.一种核苷酸，其编码如权利要求1或2所述的尿酸酶变体。
4.一种载体，所述载体包含权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：王天赐，周友浪，王蕾，
申请(专利权)人：江苏恰瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。