【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及双特异性抗体，具体为一种纯化双特异性抗体的纯化方法。
技术介绍
1、免疫治疗是目前肿瘤治疗的新方向，通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞，普通的肿瘤治疗性抗体只能结合单一的抗原，而且无法有效地聚集于肿瘤组织处，这可能是其疗效不高或响应率低的一大原因。
2、双特异性抗体(bsabs)是一类具有双功能的人工抗体分子，能同时特异性结合两种不同的抗原，它可以把免疫细胞、病毒分子等连接到肿瘤细胞上，增强对靶细胞的杀伤作用；同时可在同一肿瘤细胞上结合不同抗原以增强其结合特异性，减少脱靶毒性等副作用。
3、双特异性抗体能在靶细胞和功能分子(细胞)间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景，此外，双功能抗体药物还在自身免疫疾病、感染类疾病、组织再生和临床诊断领域也有应用。
4、双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，一般分为两大类，一类是含fc区的双特异性抗体，一类是不含fc区的双特异性抗体。但大多都是具有fc段结构，因而可以使用protein a亲和层析或者protein a联合sec或离子交换或疏水层析进行分离纯化，但对于具有共同的igg重链和两条不同的轻链的双特异性抗体，即kappa/lambda一体的双特异性抗体，在表达过程中可以出现多种形式错配或掉链的情形，此时再运用上述方法，一般需要多种方法联用，条件摸索比较困难，费时费力，而很难达到高效率的分离效果，由
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种纯化双特异性抗体的纯化方法，以解决上述
技术介绍
中的问题。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种纯化双特异性抗体的纯化方法，包括以下步骤：
3、s1，发酵液澄清；
4、s2，亲和层析，用capto l捕获双特异抗体；
5、s3，用阴离子进行双特异抗体精细纯化：
6、用阴离子填料去除hcp、片段及聚集体；
7、s4，用阳离子进行双特异抗体精细纯化：
8、用阳离子填料进一步去除hcp、电荷异构体、大量片段及聚集体，使其纯度均达到＞95％，并去除大量hcp。
9、优选的，所述发酵液澄清可采用以下三种方式中的任何一种：
10、①、发酵液配平离心后进行澄清；
11、②、发酵液加硅藻土经过粗滤膜过滤后进行澄清；
12、③、发酵液经过膜包处理进行澄清过滤。
13、优选的，所述发酵液澄清的澄清方式为：
14、发酵液加硅藻土经过粗滤膜过滤后进行澄清。
15、优选的，所述亲和层析采用蛋白l的填料capto l，所述亲和层析的具体步骤如下：
16、s2.1，平衡：
17、使用平衡缓冲液平衡，平衡液为：50mm pb，ph6.5；
18、s2.2，上样：
19、上样载量≤5mg/ml，保留时间5min，上样完成后，用平衡液冲洗去除未结合物；
20、s2.3，平衡：
21、使用平衡缓冲液平衡，平衡液为：50mm pb，ph6.5；
22、s2.4，冲洗：
23、用冲洗液100mm gly，ph4.5，进行冲洗杂质；
24、s2.5，洗脱：
25、洗脱液进行洗脱，洗脱液1：100mm hac-na，ph3.0洗脱液2：100mm gly-hcl，ph3.0，两种洗脱液任选一种；
26、洗脱样处理：用洗脱液稀释至0.5-1.5mg/ml，回调ph6.0-8.0后0.22μm针头滤器过滤。
27、优选的，所述阴离子进行双特异抗体精细纯化的填料选自capto q、capto adhere中的一种；所述阴离子进行双特异抗体精细纯化的具体步骤如下：
28、s3.1，平衡：
29、使用平衡缓冲液平衡，平衡液为：20mm tris，ph8.0；
30、s3.2，上样：
31、样品调ph到8.0后上样，上样载量≤5mg/ml，保留时间5min，上样开始时，样品经过层析柱后不和填料结合，收集流穿样；
32、s3.3，平衡：
33、使用平衡缓冲液平衡，平衡液为：20mm tris，ph8.0。
34、优选的，所述阳离子进行双特异抗体精细纯化的填料选自poros 50hs、nanogel-50sp、capto s impact中的一种，所述阳离子进行双特异抗体精细纯化的具体步骤如下：
35、s4.1，平衡：
36、使用平衡缓冲液平衡，平衡液为：平衡液：20mm citric-na，ph6.0-6.5；
37、s4.2，上样：
38、上样载量≤5mg/ml，样品调ph6.5后上样，保留时间5min，上样完成后，用平衡液冲洗去除未结合物；
39、s4.3，洗脱：
40、洗脱液：20mm citric-na、0.5m nacl，ph6.0-6.5；
41、当前洗脱方式为线性洗脱洗脱范围：0-250mmol nacl，ph6.0-6.5；
42、样品去除大部分聚体及片段sec纯度＞99％，电荷主峰纯度＞90％，hcp＜5ppm。
43、本专利技术至少具备以下有益效果：
44、本专利技术提供的一种纯化双特异性抗体的纯化方法，采用轻链select层析色谱纯化双特异性抗体，并结合阴阳离子的纯化方法，操作简单，特异性强，载量高，相对于常规的纯化方法protein l后加sec或离子交换或疏水层析，本专利技术亲和层析加阴阳离子交换去除杂质片段、聚体、电荷异构体和hcp效果更好。
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1.一种纯化双特异性抗体的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种纯化双特异性抗体的纯化方法，其特征在于，所述发酵液澄清可采用以下三种方式中的任何一种：
3.根据权利要求2所述的一种纯化双特异性抗体的纯化方法，其特征在于，所述发酵液澄清的澄清方式为：
4.根据权利要求1所述的一种纯化双特异性抗体的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析采用蛋白L的填料capto L，所述亲和层析的具体步骤如下：
5.根据权利要求1所述的一种纯化双特异性抗体的纯化方法，其特征在于，所述阴离子进行双特异抗体精细纯化的填料选自capto Q、capto adhere中的一种；所述阴离子进行双特异抗体精细纯化的具体步骤如下：
6.根据权利要求1所述的一种纯化双特异性抗体的纯化方法，其特征在于，所述阳离子进行双特异抗体精细纯化的填料选自POROS 50HS、NanoGel-50SP、capto S impact中的一种，所述阳离子进行双特异抗体精细纯化的具体步骤如下：
【技术特征摘要】
1.一种纯化双特异性抗体的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种纯化双特异性抗体的纯化方法，其特征在于，所述发酵液澄清可采用以下三种方式中的任何一种：
3.根据权利要求2所述的一种纯化双特异性抗体的纯化方法，其特征在于，所述发酵液澄清的澄清方式为：
4.根据权利要求1所述的一种纯化双特异性抗体的纯化方法，其特征在于，所述亲和层析采用蛋白l的填料capto l，所述亲和层析的具体步骤如下：
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【专利技术属性】
技术研发人员：赵焕荣，孙利燕，付明波，李芳，狄春辉，
申请(专利权)人：北京力邦生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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