【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞培养，尤其涉及一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法。
技术介绍
1、肠上皮细胞是一类位于肠隐窝处的肠道干细胞经增殖分化形成的异质细胞群，包括肠分泌细胞，肠吸收细胞、杯状细胞、内分泌细胞、潘氏细胞、m细胞tuft细胞。这些不同功能的亚型细胞彼此紧密配合，共同维持肠道吸收转运和免疫防御等生理过程。传统的单一类型肠上皮细胞层缺乏结构和组成的复杂性，无法模拟体内肠道真实生理情况。
2、肠类器官培养技术是一种基于肠道干细胞的体外培养系统，通过分离肠道组织中隐窝细胞团并将细胞置于立体支架和含特定生长因子的培养基中，模拟隐窝细胞团中肠道干细胞增殖分化所需的微环境，重建出多种肠上皮细胞类型和类似的“隐窝-绒毛”轴生理结构。与传统单细胞层培养相比，肠类器官具有更接近体内生理细胞组成和行为，已成为研究肠道营养吸收、肿瘤发生和病原体感染等领域的新型体外研究模型。
3、目前人和小鼠的小肠类器官培养技术已非常成熟，但关于鸡肠道类器官培养的相关报道还较少。在目前的分离和培养方法下，鸡小肠隐窝细胞团中散落单细胞含量高(主要为成纤维细胞)，隐窝细胞团生长速度慢、易发生凋亡，难以出现囊样结构和芽状结构等，限制了鸡小肠类器官体外培养及其在研究家禽肠道生理、病理中的应用。与此同时，还存在以下问题：肠隐窝细胞团培养得到的肠类器官缺乏免疫细胞，无法探究肠黏膜免疫应答中上皮细胞与免疫细胞之间的相互作用。因此，在体外构建肠类器官与免疫细胞共培养模型也是亟待解决的问题之一。
4、现有技术中，关于鸡肠道类器官培养的方
技术实现思路
1、目前，存在尚未出现鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的问题，为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法。
2、本专利技术的具体技术方案为：
3、本专利技术提供了一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，包括以下步骤：
4、(1)分离隐窝细胞：从胚蛋中取出十二指肠至空肠前肠的肠段，转移至含有青霉素-链霉素双抗的pbs中，去除肠系膜、胰腺组织后，纵向剪开肠段，清洗后剪块，消化，离心，取沉淀加入含fbs的dmem/f12培养基中，取通过100目细胞筛且未通过350目细胞筛的细胞，即得隐窝细胞；
5、(2)预培养鸡肠类器官：取步骤(1)得到的隐窝细胞用鸡肠类器官培养基培养至出现囊状结构，得到预培养鸡肠类器官；
6、(3)构建鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型：取步骤(2)得到的预培养鸡肠类器官与免疫细胞接种于鸡肠类器官培养基中进行培养，得到鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型；
7、其中，所述鸡肠类器官培养基以advanced dmem/f12与wnt3a细胞条件性培养基为基础培养基，advanced dmem/f12与wnt3a细胞条件性培养基体积比为60～90:10～40；
8、所述鸡肠类器官培养基含有如下终浓度的组分：
9、人源表皮生长因子20～50ng/ml。
10、本专利技术提供的鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，包括上述步骤(1)～(3)，其中，步骤(1)为隐窝细胞团的分离步骤，步骤(2)为预培养鸡肠类器官，步骤(3)为将预培养得到的鸡肠类器官与免疫细胞共同培养步骤，由此获得鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型。
11、本专利技术发现，鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型难以构建的原因主要在于，鸡小肠隐窝细胞团分离时散落单细胞含量高、分离后培养生长速度慢。肠上皮细胞间的树突细胞在抗原信息呈递、维持肠道免疫稳态及调节肠道干细胞增殖分化中具有重要的意义。为解决鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建问题，本专利技术通过改进鸡肠隐窝细胞团的分离方法，并针对鸡肠类器官生长特点选择特定生长因子进行调和及配比，实现鸡肠类器官与鸡树突细胞共同培养，成功构建一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型。
12、在本专利技术提供的构建方法中，通过步骤(1)实现对鸡肠隐窝细胞团的分离，单细胞含量低，可以避免肠组织中成纤维细胞、内皮细胞等其余细胞对细胞培养的过程造成影响。其中，青霉素-链霉素双抗的使用可以保持细胞的纯度和活力，预防细胞感染。取通过100目细胞筛且未通过350目细胞筛的细胞为进行后期培养的隐窝细胞，散落单细胞数显著减少，细胞悬液中隐窝细胞团密度明显增加，有利于后续肠隐窝类器官的培养并减少其余非肠上皮细胞的污染。配合本专利技术提供的鸡肠类器官培养基，培养生长速度快，可以实现肠道干细胞快速增殖，具体表现为：培养数小时后细胞即呈球形结构；培养2天后可见明显囊状结构；培养3天后可出现代表肠隐窝的芽状结构。
13、作为本专利技术上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述胚蛋为16-17胚龄的胚蛋。
14、本专利技术用于分离隐窝细胞团的肠段来源于鸡胚蛋，具体来源于16-17胚龄的胚蛋。取16-17胚龄的胚蛋中的十二指肠至空肠前肠的肠段，进行隐窝细胞团的分离，得到的隐窝细胞团生长速度快，培养效果较好。
15、作为本专利技术上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述消化的方法包括以下步骤：加入ⅰ型胶原酶，35～40℃恒温振荡40～50min。
16、消化步骤是分解细胞间连接的基础。通过消化，从肠段中分离出隐窝细胞，然后进一步通过离心、取沉淀过筛获得所需隐窝细胞。在本专利技术中，消化通过加入ⅰ型胶原酶、在35～40℃恒温振荡40～50min来实现。其中，在ⅰ型胶原酶中，加入适量青霉素-链霉素双抗和cacl2，对于保持细胞的纯度和活力具有重要作用，有利于提高消化效果。
17、在本专利技术提供的构建方法中，通过步骤(2)实现对鸡肠隐窝细胞团的预培养，预培养过程中，保证步骤(1)得到的鸡肠隐窝细胞团细胞数与本专利技术提供的鸡肠类器官培养基的一定配比，鸡肠隐窝细胞团培养生长速度快，培养数小时后细胞即呈球形结构、培养2天后可见明显囊状结构、培养3天后可出现代表肠隐窝的芽状结构。以步骤(2)进行可以实现肠道干细胞快速增殖。以该步骤预培养得到的隐窝细胞进行鸡肠类器本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：所述鸡肠类器官培养基还含有如下终浓度的组份：
3.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：所述鸡肠类器官培养基还含有如下终浓度的组份：
4.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：Advanced DMEM/F12与Wnt3a细胞条件性培养基的体积比为70～80:20～30。
5.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述胚蛋为16-17胚龄的胚蛋。
6.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述消化的方法包括以下步骤：加入Ⅰ型胶原酶，35～40℃恒温振荡40～50min。
7.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：步骤(2)中，培养的时间为2
8.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：步骤(3)中，培养的条件包括：每100μL鸡肠类器官培养基加入66～100个隐窝细胞。
9.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：步骤(3)中，培养的条件包括：按细胞数计，预培养鸡肠类器官细胞与免疫细胞的比例为1:5～30。
...【技术特征摘要】
1.一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
2.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：所述鸡肠类器官培养基还含有如下终浓度的组份：
3.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：所述鸡肠类器官培养基还含有如下终浓度的组份：
4.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：advanced dmem/f12与wnt3a细胞条件性培养基的体积比为70～80:20～30。
5.如权利要求1所述的一种鸡肠类器官与免疫细胞共培养模型的构建方法，其特征在于：步骤(1)中，所述胚蛋为16-17胚龄的胚蛋。
【专利技术属性】
技术研发人员：占秀安，徐义斌，丁小青，付爱坤，王园园，李丹蕾，梁霜，谢玲钰，张运锋，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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