【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，涉及工业微生物育种，具体涉及到一种生产鸟苷的基因工程菌株的构建方法。
技术介绍
1、鸟苷(guanosine)，又名9-β-d-呋喃核糖基鸟嘌呤，在生物医药和食品工业领域有着广泛的应用。核苷类化合物是抗癌、抗病毒药物的主要来源，鸟苷是抗病毒核苷类相关药物如利巴韦林、阿昔洛韦等的成分，对庖疹、感冒病毒、抗肝炎等有十分确切的疗效。此外，鸟苷能够在衰老过程中保护神经胶质，已被证明在神经细胞的体外和体内损伤模型中发挥有益作用[1,2]。鸟苷还可用于合成食品调味剂5’-鸟苷酸二钠和呈味核苷酸二钠的原料。随着未来食品和医药领域产业发展，鸟苷需求以每年10％～20％的速度增加，市场前景非常乐观。
2、目前，合成核苷的方法主要包括化学合成法、酶法和微生物发酵法。其中化学法成本高，会造成严重的环境污染。酶法需要高质量原料，存在复杂产品分离过程。由于微生物发酵法具有成本低、环境污染小且经济效益高等优点，已成为核苷的主要生产方式。鸟苷作为核苷的一种，微生物发酵法生产核苷主要是通过嘌呤从头合成途径来合成，利用磷酸核糖、氨基酸、一碳单位及co2等简单物质为原料，经过一系列的酶促反应合成嘌呤核苷酸(图1)。具体过程为：葡萄糖进入胞内磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖经pp途径生成前体prpp。prpp经十几步反应生成imp。imp经三步反应生成鸟苷，同时imp也可向腺苷和肌苷转化。近年来，虽然通过微生物细胞工厂构建和发酵优化可以提高尿苷、肌苷和鸟苷的产量[3-7]，但鸟苷发酵产量还未得到明显改善。提高产量仍是鸟苷发
3、[1]souzadg,bellaver b,bobermin ld,et al.anti-aging effectsofguanosine in glial cells.purinergic signal.2016,12(4):697-706。
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技术实现思路
1、本专利技术解决的技术问题是提供了一种鸟苷产量高效的生产鸟苷的基因工程菌株的构建方法。
2、本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种生产鸟苷的基因工程菌株的构建方法，其特征在于具体步骤为：
3、步骤s1，针对大肠杆菌mg1655菌株敲除laci基因；
4、步骤s2，将purek、purbcsq、purlf、purmnhd基因依次利用ptrc启动子驱动表达，分别整合到大肠杆菌mg1655yghx、ypjc-iley、flik、lacz基因位点上，用于强化大肠杆菌嘌呤合成途径；
5、步骤s3，将ecprs基因、ecprsd128a基因、突变baprs基因分别利用ptrc启动子驱动表达整合到大肠杆菌mg1655 asla-glmz基因位点上，用于增加前体prpp供给；
6、步骤s4，敲除gsk基因，用于减少鸟苷转化为imp，敲除deod基因、ppnp基因、riha基因、rihb基因和rihc基因，用于减少产物鸟苷转化为其它物质；
7、步骤s5，通过敲除pura、ecpura基因替换为bspurap242n突变基因(pura位点)、pura添加ssra降解标签(das+4)(yjet位点)，用于弱化腺苷支路；
8、步骤s6，通过敲除purr基因，阻遏蛋白基因purr的中断，使嘌呤核苷酸生物合成酶表达；
9、步骤s7，通过敲除pfka、弱启动子pj23116过表达大肠杆菌glpx基因(pfka位点)、弱启动子pj23116过表达枯草芽孢杆菌glpx基因(pfka位点)，弱化emp途径，通过敲除eda和edd基因，弱化ed途径。
10、本专利技术与现有技术相比具有以下优点和有益效果：本专利技术采用crispr/cas9技术对escherichia colimg1655菌株进行遗传改造，通过敲除laci基因、强化嘌呤合成途径、增加前体prpp供给、减少鸟苷降解、弱化腺苷合成支路、解除反馈抑制、弱化emp和ed途径策略对e.colimg1655进行多方面遗传改造，构建一株稳定高产鸟苷的大肠杆菌工程菌。迄今为止，通过基因编辑策略构建合成鸟苷的大肠杆菌细胞工厂工艺路线尚未见相关报道。
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1.一种生产鸟苷的基因工程菌株的构建方法，其特征在于具体步骤为：
【技术特征摘要】
1.一种生产鸟苷的基因工程菌株的...
【专利技术属性】
技术研发人员：张昆，秦梦星，王海磊，王振宇，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：
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