【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种纽莫康定b0的基因工程菌及其制备方法和应用。
技术介绍
1、纽莫康定b0(pneumocandin b0)是棘白菌素类抗真菌药物卡泊芬净(caspofungin)的前体。棘白菌素类化合物可以通过非竞争性抑制真菌细胞壁中的β-1,3-d-葡聚糖合成酶活性而抑制真菌细胞壁的合成。
2、纽莫康定b0是由苏氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、3,4-二羟基高酪氨酸、3-羟基谷氨酰胺、反式-3-羟基脯氨酸、4,5-二羟基鸟氨酸这6个氨基酸组成的肽环，通过肽环上的4,5-二羟基鸟氨酸的氨基酸残基n-末端连接一个10,12-二甲基肉豆蔻酸组成的酯肽。
3、目前，丝状真菌glarea lozoyensis是生产纽莫康定b0的重要的工业生产菌。
4、2013年，刘杏忠课题组和安志强课题组在完成了g.lozoyensis atcc 20868(纽莫康定a0高产菌株)基因组测序的基础上，发现了合成纽莫康定b0的基因簇，确定了纽莫康定b0的生物合成途径为i型聚酮合酶(polyketide synthase，pks)-非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase，nrps)杂合途径。纽莫康定b0生物合成基因簇全长约116kb，包含聚酮合酶(glpks4)、非核糖体肽合成酶(glnrps4)、高酪氨酸合成酶系(glarea37-40)、多个加氧酶p450、一个锌指转录因子(glarea10050)和一个abc转运体(glarea10036)。
5、纽
6、纽莫康定b0的生产涉及到杂质纽莫康定c0的去除，文献《crispr/cas9-basedgenome editing in the filamentous fungus glarea lozoyensis and itsapplication in manipulating glof》公开了采用crispr/cas9基因编辑技术对菌株g.lozoyensis sipi1208进行改造的方法，敲除glof基因，替换为ap-htye基因，进而得到一个新的菌株，新的菌株用于生产纽莫康定b0可以很好的避免杂质纽莫康定c0的产生。然而，对于纽莫康定b0生产菌株中其它关键基因如gloa、glod、glol并未做研究。其中g.lozoyensis sipi1208基因簇中gloa、glod和glol分别对应g.lozoyensis atcc 20868中的glnrps4(非核糖体肽合成酶，nonribosomal peptide synthetase)、glligase(酰基amp连接酶，acetyl-coa synthetase)和glpks4(聚酮合酶，polyketide synthase)。
7、因此，对于纽莫康定b0生产菌株中其它关键基因的研究对于纽莫康定b0的产量提升也特别重要。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是为克服现有技术中纽莫康定b0合成产量较低、生产成本高的缺陷，提供一种基因工程菌、其制备方法，及其在制备纽莫康定b0中的应用。利用本专利技术基因工程菌生产纽莫康定b0具有产量高且整体成本低的优势。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种基因工程菌，其出发菌株为丝状真菌glarea lozoyensis，所述基因工程菌过表达编码非核糖体肽合成酶的基因；所述非核糖体肽合成酶的ncbi登录号为xp_008078276.1。
3、在某些实施例中，编码所述非核糖体肽合成酶的基因的ncbi登录号为xm_008080085.1；和/或，所述丝状真菌glarea lozoyensis为g.lozoyensis atcc 20868。
4、优选地，所述过表达是利用强启动子使丝状真菌glarea lozoyensis的基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因过表达；
5、所述强启动子选自gpd启动子或tef1启动子；所述gpd启动子的核苷酸序列如seqid no:4所示；所述tef1启动子的核苷酸序列如seq id no:6所示。
6、在某些实施例中，所述强启动子整合于g.lozoyensis atcc 20868的基因组上，并使编码所述非核糖体肽合成酶的基因过表达。
7、较佳地，所述整合是将所述基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因的原启动子替换为所述强启动子。
8、本专利技术第二方面提供一种制备如本专利技术第一方面所述的基因工程菌的方法，所述方法包括以下步骤：将含有强启动子的质粒或线性片段转化入丝状真菌glarealozoyensis细胞内，使所述强启动子替换所述基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因的原启动子，获得过表达编码非核糖体肽合成酶的基因的基因工程菌；所述强启动子选自gpd启动子或tef1启动子；所述gpd启动子的核苷酸序列如seq id no:4所示；所述tef1启动子的核苷酸序列如seq id no:6所示。
9、较佳地，所述替换使用crispr/cas9基因编辑技术进行。
10、在某些实施例中，所述丝状真菌glarea lozoyensis在所述转化前通过溶解细胞壁的酶液酶解其细胞壁。
11、较佳地，所述酶液包括丝状真菌细胞壁溶解酶(yatalase)、溶壁酶(lyticase)、纤维素酶(cellulase)中的一种或多种。
12、更佳地，所述酶液包括：2％丝状真菌细胞壁溶解酶、3％溶壁酶、1％纤维素酶，所述％为g/100ml。
13、本专利技术第三方面提供一种纽莫康定b0的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因工程菌，其出发菌株为丝状真菌Glarea lozoyensis，其特征在于，所述基因工程菌过表达编码非核糖体肽合成酶的基因；所述非核糖体肽合成酶的NCBI登录号为XP_008078276.1。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，编码所述非核糖体肽合成酶的基因的NCBI登录号为XM_008080085.1；和/或，所述丝状真菌Glarea lozoyensis为G.lozoyensisATCC 20868；
3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述强启动子整合于G.lozoyensisATCC 20868的基因组上，并使编码所述非核糖体肽合成酶的基因过表达；
4.一种制备如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将含有强启动子的质粒或线性片段转化入丝状真菌Glarea lozoyensis细胞内，使所述强启动子替换所述基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因的原启动子，获得过表达编码非核糖体肽合成酶的基因的基因工程菌；所述强启动子选自gpd启动子或Tef1启动子；所述gpd启动子的
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述丝状真菌Glarea lozoyensis在所述转化前通过溶解细胞壁的酶液酶解其细胞壁；
6.一种纽莫康定B0的制备方法，其特征在于，其包括：在适合培养如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌的条件下发酵即得；
7.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括启动子，编码非核糖体肽合成酶的基因和终止子；
8.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括如权利要求7所述的表达盒；优选所述的重组质粒的骨架质粒为pUC57质粒。
9.一种重组质粒组合，其特征在于，其包括Cas9表达质粒、sgRNA质粒，以及如权利要求8所述的重组质粒；所述Cas9表达质粒和sgRNA质粒的线性片段用于将如权利要求7所述的表达盒同源重组至纽莫康定B0的生产菌的基因组中；
10.如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌或如权利要求7所述的表达盒或如权利要求8所述的重组质粒或如权利要求9所述的重组质粒组合在制备纽莫康定B0中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其出发菌株为丝状真菌glarea lozoyensis，其特征在于，所述基因工程菌过表达编码非核糖体肽合成酶的基因；所述非核糖体肽合成酶的ncbi登录号为xp_008078276.1。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，编码所述非核糖体肽合成酶的基因的ncbi登录号为xm_008080085.1；和/或，所述丝状真菌glarea lozoyensis为g.lozoyensisatcc 20868；
3.如权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述强启动子整合于g.lozoyensisatcc 20868的基因组上，并使编码所述非核糖体肽合成酶的基因过表达；
4.一种制备如权利要求1-3任一项所述的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将含有强启动子的质粒或线性片段转化入丝状真菌glarea lozoyensis细胞内，使所述强启动子替换所述基因组中编码非核糖体肽合成酶的基因的原启动子，获得过表达编码非核糖体肽合成酶的基因的基因工程菌；所述强启动子选自gpd启动子或tef1启动子；所述gpd启动子的核苷酸序列如s...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴燕，邢丽彤，王舒，田振华，
申请(专利权)人：弈柯莱生物科技集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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