【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体为cas12f1a蛋白及其用途。
技术介绍
1、crispr-cas系统是由成簇规则间隔的短回文重复序列(clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats，crispr)和crispr相关蛋白(crispr-associated protein，cas)组成，存在于大部分的古细菌和细菌中。crispr-cas作为古细菌和绝大多数细菌的获得性免疫系统，发挥抵御外源核酸、质粒和病毒入侵的功能。按照cas蛋白的组成可以将crispr-cas系统可分为两类：第1类系统依赖的cas蛋白为多亚基蛋白复合物，第2类系统依赖的cas蛋白为单一效应蛋白。最为常用的crispr-cas9，crispr-cas12和crispr-cas13系统均属于第二类系统。对crispr-cas系统的免疫机制进行研究和改造后，实现了将其应用于特异性分子靶标检测，发展出了基于crispr-cas系统的分子检测技术。基于cas12和cas13的核酸检测方法依赖于cas蛋白的反式切割活性，当cas蛋白与grna(guide rna，向导rna)、靶核酸序列形成效应复合物时，其附属切割活性被激活，对已被标记的dna或rna探针序列进行切割，从而释放出信号达到检测效果。
2、cas12f1(又称cas14a1)是迄今为止记录的最小的第2类crispr-cas效应子，长度在400到700个氨基酸之间。与其他常用cas蛋白(cas9,cas13a，cas12a和cas12b)不
3、crispr-cas12和crispr-cas13是最常用的基于crispr原理的分子检测系统，如何快速、简便、廉价、精确的检测仍然是改进检测技术的重要方向，尤其是如何对核酸进行多重检测，是急待解决的问题。现有的研究认为，crispr-cas12f1系统特异性地靶向dna并激活其反式dnase活性，且不具有rnase活性，从而只切割标记的ssdna探针序列。crispr-cas13a系统特异性地靶向rna并激活其反式rnase活性，且不具有dnase活性，从而只切割标记的rna探针序列。如结合使用这两个系统，就可实现单管同时检测两种靶标而不互相干扰。但是我们的研究表明，cas12f1具有自主性的rnase活性，该活性不依赖于靶标核酸或sgrna的激活，其蛋白本身自主存在。这使得如果结合使用crispr-cas13a和crispr-cas12a两种系统，cas13a反式rnase活性与cas12f1自主rnase活性相互干扰，导致错误的检测结果。
4、如何消除cas12f1自主rnase活性而只保留可激活的反式dnase活性，是crispr-cas13a和crispr-cas12a能结合使用的前提。
技术实现思路
1、为了克服上述技术问题，本专利技术提供了一种检测灵敏度、准确性更好以及检测时间短的试剂盒以及其使用方法。
2、本专利技术提供一种cas12f1蛋白突变体，所述cas12f1蛋白突变体在野生型上发生k173a、k186a、k196a、k198a中的一种突变，所述cas12a蛋白突变体的氨基酸序列如seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4所示。
3、本专利技术还提供一种核酸分子，所述核酸分子包含如上所述的cas12f1蛋白突变体的核酸序列，序列如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示。
4、本专利技术还提供一种表达载体，所述表达载体含有如上所述的核酸分子。
5、本专利技术还提供一种crispr-cas12f1系统，所述crispr-cas12f1系统包括第一向导rna和如上所述的cas12f1蛋白突变体。
6、本专利技术提供的crispr-cas12f1系统用于可应用于体内外基因编辑中，降低对细胞内rna的非特异性脱靶效应或者制备治疗疾病的药物中的用途。
7、本专利技术还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一向导rna、如上所述的蛋白突变体和第一检测核酸。
8、本专利技术还提供一种双重检测试剂盒，所述试剂盒包含试剂盒包含第一向导rna、如上所述的蛋白突变体、第一检测核酸、第二向导rna、cas13a蛋白和第二检测核酸。
9、进一步的，所述试剂盒中还包括两种不同标记的核酸(ssdna，rna)探针。
10、本专利技术还提供非疾病诊断目的的对样品中的靶核酸进行双重检测的方法，将样品包括将样品与如上所述的试剂盒中的检测组合物接触，检测由cas蛋白切割核酸探针产生的可检测信号，从而检测靶核酸。
11、进一步的，所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。
12、进一步的，所述检测探针的5’端和3’端分别设置不同的报告基团
13、进一步的，所述靶核酸来源于病毒核酸、细菌核酸或与疾病相关的特异核酸。
14、进一步的，所述靶核酸包括单链核酸、双链核酸。
15、本专利技术中的可检测信号可以是当切割检测核酸时产生的任何信号，例如，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，基于荧光信号的检测，胶体相变/分散，电化学检测，基于半导体的传感。所述可检测信号可通过任何合适的方式读出，包括但不限于：可检测的荧光信号的测量，凝胶电泳检测(通过检测凝胶上的条带的变化基于视觉或传感器的颜色的存在或不存在的检测、或者颜色存在的差异(例如，基于金纳米颗粒)以及电信号的差异。
16、本专利技术中的可检测信号可以是定量的，也可以是定性的。
17、本专利技术中，检测核酸两端加的标签为分别设置的荧光基团和猝灭基团，当检测核酸被被切割后，可以表现出可检测的荧光信号。所述荧光基团选自fam、fitc、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas red或lc red460中的一种或任意几种；所述淬灭基团选自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种Cas12f1蛋白突变体，其特征在于：所述Cas12f1蛋白突变体在野生型上发生K173A、K186A、K196A、K198A中的一种突变，所述Cas12f1蛋白突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。
2.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包含编码权利要求1所述的Cas12f1蛋白突变体的核酸序列，序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示。
3.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种CRISPR-Cas12f1系统，其特征在于：所述CRISPR-Cas12f1系统包括第一向导RNA和权利要求1所述的Cas12f1蛋白突变体。
5.权利要求4所述的CRISPR-Cas12f1系统用于可应用于体内外基因编辑中，降低对细胞内RNA的非特异性脱靶效应或者制备治疗疾病的药物中的用途。
6.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含第一向导RNA、
7.一种双重检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含第一向导RNA、权利要求1所述的蛋白突变体、第一核酸探针、第二向导RNA、Cas13a蛋白和第二核酸探针。
8.一种非疾病诊断目的的对样品中的靶核酸进行双重检测的方法，其特征在于：所述方法包括将样品与权利要求7中所述的试剂盒中的检测组合物接触，检测由Cas蛋白切割核酸探针产生的可检测信号，从而检测靶核酸。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述可检测信号通过以下方式进行检测：基于视觉的检测，基于传感器的检测，颜色检测，基于金纳米颗粒的检测，荧光偏振，胶体相变/分散，电化学检测和基于半导体的检测。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述核酸探针的5’端和3’端分别设置不同的报告基团。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述靶核酸来源于病毒核酸、细菌核酸或与疾病相关的特异核酸。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于：靶核酸包括单链核酸、双链核酸。
...【技术特征摘要】
1.一种cas12f1蛋白突变体，其特征在于：所述cas12f1蛋白突变体在野生型上发生k173a、k186a、k196a、k198a中的一种突变，所述cas12f1蛋白突变体的氨基酸序列如seq idno.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4所示。
2.核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包含编码权利要求1所述的cas12f1蛋白突变体的核酸序列，序列如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示。
3.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体含有权利要求2所述的核酸分子。
4.一种crispr-cas12f1系统，其特征在于：所述crispr-cas12f1系统包括第一向导rna和权利要求1所述的cas12f1蛋白突变体。
5.权利要求4所述的crispr-cas12f1系统用于可应用于体内外基因编辑中，降低对细胞内rna的非特异性脱靶效应或者制备治疗疾病的药物中的用途。
6.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴青，胡克平，
申请(专利权)人：中国医学科学院药用植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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