【技术实现步骤摘要】
本申请属于生物医药工程领域，特别涉及一种低毒类脂a及制备方法和作为免疫佐剂的应用。
技术介绍
1、脂多糖lps是肠道细菌产生的一种内毒素，是大多数革兰氏阴性菌的外膜外部小叶(external leaflet)的主要表面分子，并且仅仅存在于外部小叶中。lps能阻止血清补体和吞噬细胞对细菌破坏，并且与细菌群集(colonization)的粘附有关。lps能特异性激活宿主细胞的细胞膜表面toll样受体4(toll-like receptor 4，tlr4)及其信号级联途径的免疫反应，继而引发细胞内一系列的生理生化反应，上调抗原提呈细胞的共刺激分子表达水平和tnf-α、il-6、il-8等促炎性细胞因子分泌，从而增强针对抗原th1型免疫应答，这一特性使其具备开发成疫苗佐剂的潜质。因此，减弱lps或类脂a的毒性、同时保留其免疫刺激活性，成为目前相关研发工作中的热点。
2、lps是一组约为10,000da的复杂结构分子，由三个共价连接区域组成：1)在外部区域的o-特异性多糖链(o-抗原)；2)核心寡糖中心区域；3)类脂a-充当疏水性锚状物(anchor)的最里面区域，其包括运载长链脂肪酸的葡糖胺二糖单元，具体结构如图1所示。不同种属或者同一菌株在不同生长条件下的类脂a的结构是不同的，具体表现为磷酸基团的数量和位置、脂肪酸链的数量和长度等方面的差异。野生型大肠杆菌和沙门氏菌的lps中类脂a部分包含六条或七条脂肪酸链，并在c1位和c4位有两个磷酸基团，具有较高的细胞毒性。研究表明，脂肪酸含量和磷酸化的变化会影响类脂a的毒性与佐剂作用
3、一般认为，综合免疫刺激活性、低毒性以及其他分子特性考虑，含有6个脂肪酸链的3d-mla是最优的选择。寻求具有更加高效的lps提取方法，便于规模化生产，从而进一步制备分离具有免疫刺激性的lpa产品，开发更安全高效且具有自主知识产权的升级代tlr4配体分子以扩充已有的佐剂候选，为其他疫苗品种提供更多的佐剂选择，成为本领域技术人员急需解决的技术问题。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种低毒类脂a及用制备方法和应用。
2、本专利技术的技术方案如下：
3、本专利技术一方面提供了一种低毒类脂a，所述低毒类脂a同时包括含有4条、5条、6条或7条酰基脂肪酸链的单磷酸类脂a结构，其中0～90％的类脂a分子在磷酸基团上具有磷酸乙醇胺修饰。
4、在一些实施例中，类脂a分子具有磷酸乙醇胺修饰的比例可以等于或约等于0、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，或者可以为上述任意两个相邻的数字之间的任何数值。
5、进一步地，该类脂a的具体成分如下：
6、
7、在一些实施例中，七酰基单磷酸类脂a的含量可以等于或约等于0。
8、进一步地，所述五酰基同源物的比例高于所述六酰基同源物的比例。
9、现有研究普遍认为六酰基类脂a的免疫效果最好，但申请人在研究中意外发现，五酰基比例与免疫效果大致呈正相关关系，特别是当五酰基比例高于六酰基时，免疫效果得到显著提升，可能说明在本申请提供的这种特定组分的混合体系中，五酰基的比例越高、免疫效果越好，但仍需要进一步的证据进行支撑、才能得出明确的结论。
10、一种具体的情况是，该类脂a(下文称lpa-d-202201015)的具体成分如下：
11、
12、一种具体的情况是，该类脂a(下文称lpa-d-202201018)的具体成分如下：
13、
14、一种具体的情况是，该类脂a(下文称lpa-d-202201016)的具体成分如下：
15、
16、一种具体的情况是，该类脂a(下文称lpa-d-202201014)的具体成分如下：
17、
18、一种具体的情况是，该类脂a(下文称lpa-d-202201012)的具体成分如下：
19、
20、一种具体的情况是，该类脂a(下文称lpa-d-202112009)的具体成分如下：
21、
22、进一步地，具有磷酸乙醇胺修饰的所述六酰基同源物的结构如式(1)所示：
23、
24、其中r1、r2、r3、r4、r5以及r6分别为c10～c20烷基中的任一种，具体可以分别为c10、c11、c12、c13、c14、c15、c16、c17、c18、c19或c20烷基。
25、进一步地，所述四酰基同源物的结构如式(2)～(5)中至少一项所示：
26、
27、
28、所述五酰基同源物的结构如式(6)～(9)中的至少一项所示：
29、
30、所述六酰基同源物的结构如式(10)～(11)中的至少一项所示：
31、
32、所述七酰基同源物的结构如式(12)～(13)中的至少一项所示：
33、
34、本专利技术另一方面提供了制备上述低毒类脂a的方法，其特征在于，包括如下步骤：
35、a)构建waac和pagp双基因缺失的大肠杆菌突变株；
36、b)利用所述突变株进行有氧发酵，收获菌体培养物；
37、c)对菌体培养物进行粗制和精制，得到所述低毒类脂a。
38、waac和waaf基因编码的庚糖基转移酶ⅰ可以催化adp-l-丙三基-d-甘露庚糖连接到kdo2-lipid a，因此通过失活该基因阻断核心多糖链的合成，使细胞积累kdo2-lipida。waac基因编码的酶负责将首个庚糖转移至lps内核的kdo、waaf基因编码的酶负责将第二个庚糖转移至lps内核的kdo组分。专利技术人发现仅仅失活waac基因即可实现细胞积累kdo2-lipida的效果，并且能比同时失活waac和waaf两个基因的成功率更高、获得的基因工程菌更加稳定。
39、pagp基因编码的棕榈酰转移酶可以在lps上添加脂肪酸链，因此通过失活该基因可以减少七酰基及以上的lpa产生，同时专利技术人发现通过敲除pagp基因能够增加五酰基的产量，从而降本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种低毒类脂A，其特征在于，所述低毒类脂A同时包括含有4条、5条、6条或7条酰基脂肪酸链的单磷酸类脂A结构，其中0～90％的类脂A分子在磷酸基团上具有磷酸乙醇胺修饰。
2.如权利要求1所述低毒类脂A，其特征在于，具体成分如下：
3.如权利要求2所述的低毒类脂A，其特征在于，所述五酰基同源物的比例高于所述六酰基同源物的比例。
4.如权利要求2所述的低毒类脂A，其特征在于，具有磷酸乙醇胺修饰的所述六酰基同源物的结构如式(1)所示：
5.如权利要求2所述的低毒类脂A，其特征在于，所述四酰基同源物包括式(2)～(5)中的至少一种：
6.一种制备权利要求1～5中任一项所述的低毒类脂A的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述大肠杆菌选用DH5a、BL21、BL21plysS、JM109、TOP10、W3110、HB101菌株中的任一种，优选为BL21菌株。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述waaC基因的序列与SEQ IDNo.1至少90％相同，
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述有氧发酵包括如下步骤：
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，摇瓶培养阶段使用的培养基为LB培养基或TB培养基。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，种子罐培养阶段中，控制溶氧量DO≥30％；发酵罐培养阶段中，控制溶氧量DO≥25％。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，发酵罐培养的具体方法如下：
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述发酵罐底料培养基为2×所述种子罐培养基。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述种子罐培养基为LB培养基，所述发酵罐底料培养基为2×LB培养基。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述种子罐培养基为TB培养基，所述发酵罐底料培养基为2×TB培养基。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述补料培养中使用的补料培养基为甘油。
17.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤c)中所述粗制包括如下步骤：
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，第一次乙醇洗涤的乙醇浓度为50～70％，第二次乙醇洗涤的乙醇浓度为70～90％。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，两次乙醇洗涤的反应温度均为45～55℃，反应时间均为45～60min。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，对菌体进行洗涤的方法还包括在所述两次乙醇洗涤之前进行的水洗步骤。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，对菌体进行提取包括高温提取阶段和室温抽提阶段，所述高温提取阶段所用的提取液中氯仿含量高于甲醇含量，所述室温抽提阶段所用的抽提液中氯仿含量低于甲醇含量。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述提取液为体积比3:1～6:1的氯仿-甲醇溶液，所述抽提液为体积比1:3～1:6的氯仿-甲醇溶液。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述高温提取阶段的反应温度为50～55℃，反应时间为4～8h；所述室温提取阶段的反应时间为1～2h。
24.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述酸水解中使用的酸为盐酸，工作浓度为0.1M。
25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述酸水解的反应温度为92～98℃，反应时间为20～40min。
26.如权利要求24所述的方法，其特征在于，还包括在所述酸水解之后进行的第一萃取步骤，所述第一萃取步骤使用的萃取剂为1～5倍体积的氯仿-甲醇溶液，其中氯仿和甲醇的体积比为2:1。
27.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤c)中所述精制包括对所述粗品进行离子交换色谱层析，收集洗脱液、得到精制品。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述离子交换色谱层析采用氯仿-甲醇-水体系进行。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述离子交换色谱的填料为superQ。
30.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述氯仿-甲醇-水体系包括用于在层析前对所述粗品进行溶解的平衡液、以及用于在层析后对吸附在填料上的成分进行洗脱的洗脱液，所述平衡液与所述洗脱液均为体积比40:20:3的氯仿-甲醇-水相溶液，其中所述平衡液的水相为纯化水，所述洗脱液的水相为70～210mM ...
【技术特征摘要】
1.一种低毒类脂a，其特征在于，所述低毒类脂a同时包括含有4条、5条、6条或7条酰基脂肪酸链的单磷酸类脂a结构，其中0～90％的类脂a分子在磷酸基团上具有磷酸乙醇胺修饰。
2.如权利要求1所述低毒类脂a，其特征在于，具体成分如下：
3.如权利要求2所述的低毒类脂a，其特征在于，所述五酰基同源物的比例高于所述六酰基同源物的比例。
4.如权利要求2所述的低毒类脂a，其特征在于，具有磷酸乙醇胺修饰的所述六酰基同源物的结构如式(1)所示：
5.如权利要求2所述的低毒类脂a，其特征在于，所述四酰基同源物包括式(2)～(5)中的至少一种：
6.一种制备权利要求1～5中任一项所述的低毒类脂a的方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤a)中所述大肠杆菌选用dh5a、bl21、bl21plyss、jm109、top10、w3110、hb101菌株中的任一种，优选为bl21菌株。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述waac基因的序列与seq idno.1至少90％相同，所述pagp基因的序列与seq id no.2至少90％相同。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤b)中所述有氧发酵包括如下步骤：
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，摇瓶培养阶段使用的培养基为lb培养基或tb培养基。
11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，种子罐培养阶段中，控制溶氧量do≥30％；发酵罐培养阶段中，控制溶氧量do≥25％。
12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，发酵罐培养的具体方法如下：
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述发酵罐底料培养基为2×所述种子罐培养基。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述种子罐培养基为lb培养基，所述发酵罐底料培养基为2×lb培养基。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述种子罐培养基为tb培养基，所述发酵罐底料培养基为2×tb培养基。
16.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述补料培养中使用的补料培养基为甘油。
17.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤c)中所述粗制包括如下步骤：
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，第一次乙醇洗涤的乙醇浓度为50～70％，第二次乙醇洗涤的乙醇浓度为70～90％。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，两次乙醇洗涤的反应温度均为45～55℃，反应时间均为45～60min。
20.如权利要求17所述的方法，其特征在于，对菌体进行洗涤的方法还包括在所述两次乙醇洗涤之前进行的水洗步骤。
21.如权利要求17所述的方法，其特征在于，对菌体进行提取包括高温提取阶段和室温抽提阶段，所述高温提取阶段所用的提取液中氯仿含量高于甲醇含量，所述室温抽提阶段所用的抽提液中氯仿含量低于甲醇含量。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述提取液为体积比3:...
【专利技术属性】
技术研发人员：李颜颜，冯会强，邓壮梅，王学强，林荣，孙汉奇，吴双，刘娟，于佳平，
申请(专利权)人：江苏瑞科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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