获得雄性不育植物的分子方法技术

本发明专利技术提供了利用位点特异性重组系统介导的获得具有雄性不育性状的转基因植物的方法。用第一个重组ＤＮＡ序列和第二个重组ＤＮＡ序列稳定地转化或再转化或共转化植物细胞，其中所说的第一个重组ＤＮＡ序列包含连接到第一个花药特异性启动子后的编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列，所说的第一个花药特异性启动子和编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列之间插入了一段两侧翼接有特异性识别和剪切序列的阻断序列；其中所说的第二个重组ＤＮＡ序列包含编码识别阻断序列两侧翼的特异性识别和剪切序列的蛋白质的第二个核苷酸序列，并且所说的第二个核苷酸序列被连接到第二个特异性启动子之后；并由所说植物细胞再生得到完整的植株。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及获得转基因植物的方法，特别是涉及获得具有雄性不育性状的转基因植物的分子遗传学方法。更具体地说，本明涉及以位点特异性重组系统介导的获得具有雄性不育性状的转基因植物的方法。杂交优势的利用在植物育种中起着极为重要的作用。在植物育种中，传统的方法通常是利用不育系、恢复系和保持系三个系统获得杂交优势，以缩短育种周期，加速育种进程。然而，以常规育种方法获得的雄性不育系往往存在难以鉴定植物表型、育性不稳定和不育性容易丢失等缺点和限制因素。随着重组DNA技术和植物转化技术的进展，人们已经有可能利用遗传工程手段获得雄性不育植物及其种子。例如Mariani，C.等人(Nature，347737-741(1990))将烟草花药特异性基因TA29的启动子分别与芽孢杆菌RNA酶barnase和核糖核酸酶T1融合，并以所得到的融合基因转化植物细胞后成功地获得了雄性不育烟草和油菜植株。理论上，任何对植物雄性器官的细胞具有致死作用的蛋白质或多肽或核酸均可在特异性启动子的驱动下诱导植物的雄性不育表型。这些蛋白质或多肽或核酸包括β-1，3-葡聚糖酶(WO 97/38116)、限制性内切酶EcoR I(Barrens andRine，PNAS，821354-1358(1985))、α或β微管蛋白(PCT/GB 96/01675)、S座位特异性糖蛋白(EP-A 0825262)、哺乳动物非偶联蛋白(UCP)(WO 90/08831)、芽孢杆菌RNA酶barnase(WO 96/26283)、白喉毒素A(US 5,409,823)、链霉抗生物素(Sane and Cantor，PNAS，87142-146(1990))，以及反式激活蛋白(US5,409,823)和反义DNA(EP-A 0329308、WO 90/08828、US 5,741,684、US 5,741,926)等。上述现有技术中公开的方法基本都是用与器官、组织或细胞特异性启动子相连接的细胞毒性或致死性基因或反义核酸转化受体植物，以干扰植物雄性器官或花粉的正常发育，阻断花粉粒的形成和发育。美国专利US 5,628,772描述了在植物细胞中产生DNA的位点特异性重组的方法。所说的方法包括向细胞中导入含有loxP位点的DNA序列，并使lox位点与其后导入的植物细胞活性启动子驱动的cre编码区共存于一个细胞中以产生位点特异性重组。如果两个lox位点方向相同，将导致两个lox位点间的DNA片段被删除；如果两个lox位点方向相反，则导致两个lox位点间的DNA片段倒位。另外，US5,723,765描述了利用噬菌体cre/lox系统控制植物基因表达的方法，虽然该专利比较笼统地描述了利用位点特异性重组技术控制植物基因表达的原理，但其中并没有具体地说明该技术在产生雄性不育植物中的应用。目前研究得很清楚的位点特异性重组系统是噬菌体和酵母中的四种类型的位点特异性重组系统噬菌体P1的cre/lox系统、醇母2u质粒的FLP/FRT系统、酵母PSR1质粒的R/RS系统和噬菌体Mu的Gin/gix系统(Odell，《Recombinationand Gene Silencing in Plants》ed.Paszkowsqi，219-270(1994))。其中对噬菌体P1的cre/lox系统的研究最为深入，并已广泛地应用于植物，例如用于介导植物基因组的位点特异性重组，造成DNA片段的定位剪切、倒位、外源DNA的整合及染色体的重排。位点特异性重组系统由重组酶和其特异性识别位点组成。其中以cre为代表的重组酶对lox位点具有特异性识别能力。对人工诱变的位点特异性重组缺陷型cre突变体的体外研究证实，cre的N末端结构域参与结合位点的识别，C末端则负责对DNA的剪切(Wierzbidi A，JBC，195785-794(1987))。loxP代表噬菌体P1中的交换座位，其中两个结合区域之间的8bp间隔区决定cre介导的重组的方向性(Hoess，R，InUCLA Symposium on Molecularand Cellular Biology，Vol.147745-756)。1988年，Sauer，B.等人(PNAS 855166-5170)首先证实了cre/lox系统在酵母中介导位点特异性重组的可能性。之后，Sauer和Henderson(US 4,95,9,317)利用正选择系统显示cre可用于介导哺乳动物基因组中loxP位点间的剪切重组反应。在植物中，Dale和Ow(Gene，9179-85(1990))用瞬时分析法证明烟草原生质体中的cre可介导染色体外DNA的剪切、倒位和整合反应。证明cre可介导整合到烟草基因组中的两个loxP位点间的重组反应，并且重组频率达到100％(Odell，MGG，369-378(1990))。近年来，cre/loxP位点特异性重组系统已被广泛应用于控制植物外源基因的表达、失活或活化转基因、控制植物发育和表型特征，以及用于外源基因的位点特异性整合及染色体研究。然而，这些现有技术并没有具体地描述cre/loxP位点特异性重组系统在产生雄性不育植物方面的应用。因此，本专利技术提供用于获得雄性不育植物的分子方法，该方法包括用第一个重组DNA序列和第二个重组DNA序列稳定地转化或再转化或共转化植物细胞，其中所说的第一个重组DNA序列包含连接到第一个花药特异性启动子后的编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列，所说的第一个花药特异性启动子和编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列之间插入了一段两侧翼接有特异性识别和剪切序列的阻断序列；其中所说的第二个重组DNA序列包含编码识别阻断序列两侧翼的特异性识别和剪切序列的蛋白质的第二个核苷酸序列，并且所说的第二个核苷酸序列被连接到第二个特异性启动子之后；并由所说植物细胞再生得到完整的植株。在本专利技术的一个实施方案中，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是花药小孢子特异性启动子序列。根据本专利技术的这一实施方案，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列，并且其中所说的花药小孢子特异性启动子包括但不仅限于ntm19启动子序列。在本专利技术的另一个实施方案中，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是组成型启动子序列。根据本专利技术的这一实施方案，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列，并且其中所说的组成型启动子序列包括但不仅限于35S启动子序列。在本专利技术的另一个实施方案中，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子也是花药绒毡层细胞特异性启动子序列。根据本专利技术的这一实施方案，其中所说的第一个和第二个花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列。在本专利技术的再一个实施方案中，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是诱导型启动子序列。根据本专利技术的这一实施方案，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不本文档来自技高网...

【技术保护点】
获得雄性不育植物的分子方法，该方法包括：用第一个重组ＤＮＡ序列和第二个重组ＤＮＡ序列稳定地转化或再转化或共转化植物细胞，其中所说的第一个重组ＤＮＡ序列包含连接到第一个花药特异性启动子后的编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列 ，所说的第一个花药特异性启动子和编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列之间插入了一段两侧翼接有特异性识别和剪切序列的阻断序列；其中所说的第二个重组ＤＮＡ序列包含编码识别阻断序列两侧翼的特异性识别和剪切序列的蛋白质的第二个核苷酸序列，并且所说的第二个核苷酸序列被连接到第二个特异性启动子之后；并由所说植物细胞再生得到完整的植株。

【技术特征摘要】
1.获得雄性不育植物的分子方法，该方法包括用第一个重组DNA序列和第二个重组DNA序列稳定地转化或再转化或共转化植物细胞，其中所说的第一个重组DNA序列包含连接到第一个花药特异性启动子后的编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列，所说的第一个花药特异性启动子和编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列之间插入了一段两侧翼接有特异性识别和剪切序列的阻断序列；其中所说的第二个重组DNA序列包含编码识别阻断序列两侧翼的特异性识别和剪切序列的蛋白质的第二个核苷酸序列，并且所说的第二个核苷酸序列被连接到第二个特异性启动子之后；并由所说植物细胞再生得到完整的植株。2.根据权利要求1的方法，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是花药小孢子特异性启动子序列。3.根据权利要求2的方法，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列，并且其中所说的花药小孢子特异性启动子包括但不仅限于ntm19启动子序列。4.根据权利要求1的方法，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是组成型启动子序列。5.根据权利要求4的方法，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列，并且其中所说的组成型启动子序列包括但不仅限于35S启动子序列。6.根据权利要求1的方法，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子也是花药绒毡层细胞特异性启动子序列。7.根据权利要求6的方法，其中所说的第一个和第二个花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列。8.根据权利要求1的方法，其中所说的第一个花药特异性启动子是花药绒毡层细胞特异性启动子序列，并且第二个特异性启动子是诱导型启动子序列。9.根据权利要求8的方法，其中所说花药绒毡层细胞特异性启动子包括但不仅限于osg6B启动子序列和TA29启动子序列，并且其中所说的诱导型启动子序列包括但不仅限于MT启动子序列。10.根据权利要求1的方法，其中所说的第一个重组DNA序列中的编码植物雄性器官或组织细胞致死性蛋白质的核苷酸序列是编码芽孢杆菌RNA酶barnase的核苷酸序列，并且编码第二个重组DNA序列中识别连接在第一个重组DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：林忠平，李雷，胡鸢雷，刘松梅，甄伟，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]