【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物酶制备，具体为一种胰蛋白酶gm2938的发酵、分离、纯化的方法及其应用。
技术介绍
1、胰蛋白酶(ec 3.4.4.4)是一种丝氨酸蛋白酶水解酶，能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断，还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体。胰蛋白酶具有高稳定性、高纯度等优点，可广泛应用在生物技术工程中，包括并不限于细胞培养、食品加工、工业处理、医疗生产和胰岛素制造，并且其在医疗领域的应用是不可替代的。
2、目前主流生产胰蛋白酶主要从牛、羊、猪中提取，存在生产成本高、生产工艺复杂、杂质含量高、生产污染大等问题。为了解决动物来源胰蛋白成本高、污染大、分离纯化困难的问题。研究人员通过基因工程编辑技术，在工程菌中表达含胰蛋白酶gm2938的质粒，以图实现低成本、低污染生产等问题。胰蛋白酶gm2938稳定性良好，催化底物baee和bapan性质较突出，其胶原蛋白酶活力低，无弹性蛋白酶活，在工业处理和食品加工行业中具有很好的应用前景。
3、现有技术中胰蛋白酶gm2938的推广存在以下问题：
4、1)胰蛋白酶gm2938蛋白酶酶活力仍然较低，产量低，无法满足工业要求。
5、2)胰蛋白酶gm2938在工业处理中的具体应用并无太多探索。
6、3)目前对于菌株产胰蛋白酶分离的主要方法仍采用超滤，层析等方法，分离纯化复杂，效率低，成本高。
7、cn 110343689 a中涉及一种新型链霉菌胰蛋白酶gm2938，该胰蛋白酶gm2938稳定性良好，催化底
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种胰蛋白酶gm2938的发酵、分离、纯化的方法。通过该方法，使枯草芽孢杆菌表达胰蛋白酶gm2938的蛋白酶活从原来13u/ml提高到103.05u/ml，提高了7.93倍。分离、纯化也更简便，操作简单。
2、为了实现以上专利技术目的，本专利技术的具体技术方案为：
3、一种胰蛋白酶gm2938的发酵、分离、纯化的方法，包括以下步骤：
4、步骤1：通过酪蛋白培养基快速对表达胰蛋白酶gm2938的枯草芽孢杆菌原始菌株进行筛选；
5、步骤2：通过一级种子培养基将筛选到的菌株进行培养至od600值为14-15；再通过二级种子培养基培养至od600值34-36；最后通过三级种子培养基培养至od600值35-40；
6、步骤3：将经步骤2处理后的种子培养基接种于发酵培养基中，待发酵液ph值稳定时，控制发酵液ph值保持在该点至发酵结束，并且定时补料；
7、步骤4：将步骤3中的发酵液通过离心进行固液分离，得发酵液；
8、步骤5：将步骤4中发酵液的上清液取出，并添加硫酸铵至饱和，过夜沉淀；步骤6：收集过夜后的发酵液上层液体，并通过离心机浓缩后，使用真空冷冻干燥仪精制粉末，即得。
9、作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤2中所用的种子培养基(包括一级种子培养基、二级种子培养基和三级种子培养基)的配比为：玉米粉16g/l、豆粕18g/l、酵母膏27g/l、葡萄糖25g/l、蛋白胨5g/l、磷酸氢二钾4g/l、磷酸氢二钾1g/l，硫酸卡那霉素50μg/l，培养基初始ph值为7。
10、作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤3中所用发酵培养基的配比为：玉米粉28g/l，玉米淀粉36g/l，玉米浆21g/l，蛋白胨15g/l，豆粕25g/l，磷酸二氢钾11.2g/l，磷酸氢二钾2.8g/l，硫酸锰4g/l，柠檬酸铵7.5g/l，磷酸二铵7.5g/l，甘油2ml/l，硫酸卡那霉素50μg/l，培养基初始ph值为8。
11、作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤3中补料所用的培养基的配比为：玉米粉28g/l，蛋白胨15g/l，硫酸锰4g/l，硫酸卡那霉素50μg/l，培养基初始ph值为8。
12、作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤3中发酵条件为：ph值7.5-8.5，转速150-400rpm，风量1：0.5-1，罐压0.04-0.06mpa，温度35-37℃，发酵时间68h，发酵过程中用5mol/l的naoh自动控制发酵液ph值维持在8；一共分4批次分批补料，共计补料为初始发酵液体积的17.14％，每次补4.29％；36h时第一次补料；之后每间隔8h再补一次，60h前完成补料。
13、作为本申请中一种较好的实施方式，步骤4中固液分离的转速为16000rpm，时间10min。
14、作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤5中添加的硫酸铵的浓度为767.92g/l，处理16h。
15、作为本申请中一种较好的实施方式，所述步骤6中离心机的转速为15000rpm，将通过离心机浓缩得到的胰蛋白酶gm2938沉淀于-80℃的条件下冷冻5-6h后，在真空冷冻干燥仪中干燥30h后收集胰蛋白酶gm2938粉末，并通过蛋白酶活检测国标gbt23527-2009进行检测。
16、本专利技术的另外一个专利技术目的是保护采用以上任一方法得到的胰蛋白酶gm2938。
17、本专利技术的第三个专利技术目的是保护以上获取的胰蛋白酶gm2938的应用，将其用于皮革处理，可简化皮革软化的流程，并且软化后皮革品质较高。
18、具体应用步骤为：将依次经过浸水、脱毛、浸灰、片皮、脱灰处理后动物皮浸入在复合剂中，在40-60℃，ph 8-10的条件下反应5-6h，从而软化皮革；所述的复合剂包括水、胰蛋白酶gm2938粉末、脂肪酶、表面活性剂(tween-20、tween-80、平平加、单月桂基磷酸酯)以及edta。
19、作为本申请中一种较好的实施方式，该复合剂中，胰蛋白酶gm2938粉末为0.4-0.8％，0.1-0.8％脂肪酶，0.002％ edta，0.12％的表面活性剂，余量为水，总质量百分含量之和为100％。
20、与现有技术相比，本专利技术的积极效果体现在：
21、(一)重新配置发酵培养基，优化发酵培养基后，使枯草芽孢杆菌表达胰蛋白酶gm2938的蛋白酶活从原来13u/ml提高到103.05u/ml，提高了7.93倍。
22、(二)优化提前和分化步骤，首次对胰蛋白酶gm2938使用了饱和硫酸铵进行沉淀，极大的减少了工艺流程，同时使获取胰蛋白酶更加简便。
23、(三)配比了一种用于皮革处理的复合酶溶液，可简化皮革软化的流程，并且使软化后皮革品质较高。
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1.一种胰蛋白酶GM2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述胰蛋白酶GM2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，所述步骤2中所用的种子培养基的配比为：玉米粉16g/L、豆粕18g/L、酵母膏27g/L、葡萄糖25g/L、蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾4g/L、磷酸氢二钾1g/L，硫酸卡那霉素50μg/L，培养基初始pH值为7。
3.如权利要求1所述胰蛋白酶GM2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，所述步骤3中所用发酵培养基的配比为：玉米粉28g/L，玉米淀粉36g/L，玉米浆21g/L，蛋白胨15g/L，豆粕25g/L，磷酸二氢钾11.2g/L，磷酸氢二钾2.8g/L，硫酸锰4g/L，柠檬酸铵7.5g/L，磷酸二铵7.5g/L，甘油2mL/L，硫酸卡那霉素50μg/L，培养基初始pH值为8。
4.如权利要求1所述胰蛋白酶GM2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，所述步骤3中补料所用的培养基的配比为：玉米粉28g/L，蛋白胨15g/L，硫酸锰4g/L，硫酸卡那霉素50μg/L，培养基初始
5.如权利要求1所述胰蛋白酶GM2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，所述步骤3中发酵条件为：pH值7.5-8.5，转速150-400rpm，风量1：0.5-1，罐压0.04-0.06mPa，温度35-37℃，发酵时间68h，发酵过程中用5mol/L的NaOH自动控制发酵液pH值维持在8；一共分4批次分批补料，共计补料为初始发酵液体积的17.14％，每次补4.29％；36h时第一次补料；之后每间隔8h再补一次，60h前完成补料。
6.如权利要求1所述胰蛋白酶GM2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，步骤4中固液分离的转速为16000rpm，时间10min。
7.如权利要求1所述胰蛋白酶GM2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，所述步骤5中添加的硫酸铵的浓度为767.92g/L，处理16h。
8.如权利要求1所述胰蛋白酶GM2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于：所述步骤6中离心机的转速为15000rpm，将通过离心机浓缩得到的胰蛋白酶GM2938沉淀于-80℃的条件下冷冻5-6h后，在真空冷冻干燥仪中干燥30h后收集胰蛋白酶GM2938粉末。
9.如权利要求1-8中任一方法得到的胰蛋白酶GM2938。
10.如权利要求9所述胰蛋白酶GM2938的应用，其特征在于：所述胰蛋白酶GM2938用于在制备皮革材料的过程中软化皮革；具体应用步骤为，将依次经过浸水、脱毛、浸灰、片皮、脱灰处理后动物皮浸入在复合剂中，在40-60℃，pH 8-10的条件下反应5-6h，从而软化皮革；所述的复合剂包括水、胰蛋白酶GM2938粉末、脂肪酶、表面活性剂以及EDTA；该复合剂中，胰蛋白酶GM2938粉末为0.4-0.8％，0.1-0.8％脂肪酶，0.002％EDTA，0.12％的表面活性剂，余量为水，总质量百分含量之和为100％。
...【技术特征摘要】
1.一种胰蛋白酶gm2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.如权利要求1所述胰蛋白酶gm2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，所述步骤2中所用的种子培养基的配比为：玉米粉16g/l、豆粕18g/l、酵母膏27g/l、葡萄糖25g/l、蛋白胨5g/l、磷酸氢二钾4g/l、磷酸氢二钾1g/l，硫酸卡那霉素50μg/l，培养基初始ph值为7。
3.如权利要求1所述胰蛋白酶gm2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，所述步骤3中所用发酵培养基的配比为：玉米粉28g/l，玉米淀粉36g/l，玉米浆21g/l，蛋白胨15g/l，豆粕25g/l，磷酸二氢钾11.2g/l，磷酸氢二钾2.8g/l，硫酸锰4g/l，柠檬酸铵7.5g/l，磷酸二铵7.5g/l，甘油2ml/l，硫酸卡那霉素50μg/l，培养基初始ph值为8。
4.如权利要求1所述胰蛋白酶gm2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，所述步骤3中补料所用的培养基的配比为：玉米粉28g/l，蛋白胨15g/l，硫酸锰4g/l，硫酸卡那霉素50μg/l，培养基初始ph值为8。
5.如权利要求1所述胰蛋白酶gm2938的发酵、分离、纯化的方法，其特征在于，所述步骤3中发酵条件为：ph值7.5-8.5，转速150-400rpm，风量1：0.5-1，罐压0.04-0.06mpa，温度35-37℃，发酵时间68h，发酵过程中用5mol/l的naoh自动控制发酵液ph值维持在8；一共...
【专利技术属性】
技术研发人员：李斌，李镇江，庹有朋，陈兰，唐晓芳，叶莉，田永强，
申请(专利权)人：成都金开生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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