【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及l-谷氨酸生产能力得到提高的突变株及利用其的l-谷氨酸的制造方法，更具体而言，涉及柠苹酸合酶(citramalate synthase)的活性弱化或者失活，从而作为副产物的柠苹酸的生产量减少，l-谷氨酸的生产能力增加的棒状杆菌属(corynebacteriumsp.)突变株及利用其的l-谷氨酸的制造方法。
技术介绍
1、l-谷氨酸是通过微生物发酵进行生产的代表性氨基酸，l-谷氨酸钠(monosodiuml-glutamate，msg)平衡和协调食物的整体味道，从而提高对肉、鱼、鸡、蔬菜、酱、汤、调料等食品的喜好度，可以增进减盐30％的低盐食品的味道，因此广泛用作家庭用和用于加工食品生产的调味料。
2、通常，为了生产l-谷氨酸，主要利用短杆菌(brevibacterium)或棒状杆菌(corynebacterium)属菌株及其突变株并通过发酵进行生产。为了增加基于微生物培养的l-谷氨酸的生产量，利用了为了增加l-谷氨酸生物合成途径中基因的表达而增加相应基因的复制数，或者转变基因的启动子来调节生物合成途径上的酶活性的方法。具体而言，通过扩增pyc基因或fasr之类的特定基因(美国专利第6852516号)，或者操作gdh、glta、icd、pdh和argg基因的启动子(promoter)部位(美国专利第6962805号)来增加l-谷氨酸生产量。
3、已知柠苹酸合酶(citramalate synthase,cima)是以乙酰coa和丙酮酸为基质来合成柠苹酸的酶，cima基因不存在于谷氨酸棒状杆菌，
4、作为l-谷氨酸的发酵途径中的基质，使用乙酰coa，因此本申请的专利技术人们使柠苹酸合酶的活性弱化或者失活而节约作为基质的乙酰coa，从而进一步提高l-谷氨酸生产率。
5、另一方面，据报道棒状细菌的yggb基因是大肠杆菌(escherichia coli)的yggb基因的同源物(fems microbiol lett.2003,218(2),p305-309,mol microbiol.2004,54(2),p420-438)，是一种机械敏感通道(mechanosensitive channel)(embo j.1999,18(7):1730-7)。作为赋予棒状细菌l-谷氨酸生产能力的方法，具体而言，尚未报道如本专利技术所述的突变对l-谷氨酸生成产生的影响。
6、因此，本申请的专利技术人们制作了使柠苹酸合酶的活性弱化或者失活的突变株以及进一步对参与谷氨酸排出的yggb蛋白质诱导突变而得到的突变株，确认了上述突变株的l-谷氨酸生产能力优异，从而完成了本专利技术。
7、现有技术文献
8、专利文献
9、韩国授权专利第10-1138289号
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供柠苹酸合酶(citramalate synthase)的活性弱化或者失活且l-谷氨酸的生产能力得到提高的棒状杆菌属(corynebacterium sp.)突变株。
2、本专利技术的另一目的在于提供l-谷氨酸的制造方法，包括以下步骤：
3、(a)在培养基中培养棒状杆菌属突变株的步骤；以及
4、(b)从培养的突变株或者培养基中回收l-谷氨酸的步骤。
5、本专利技术的一个方式提供柠苹酸合酶(citramalate synthase)的活性弱化或者失活且l-谷氨酸的生产能力得到提高的棒状杆菌属(corynebacterium sp.)突变株。
6、在本专利技术中，“柠苹酸合酶”是指催化将乙酰coa和丙酮酸转化为柠苹酸和辅酶a(coenzyme a)的过程的酶。
7、在本专利技术中，“生产能力得到提高的”菌株是指与亲本菌株相比，l-谷氨酸的生产率增加的菌株。
8、在本专利技术中，“亲本菌株”是指成为突变对象的野生型或突变株，包括直接成为突变的对象或通过重组的载体等转化的对象。在本专利技术中，亲本菌株可以是野生型谷氨酸棒状杆菌菌株或由野生型突变的菌株。优选地，可以是谷氨酸棒状杆菌kctc 11558bp菌株。
9、根据本专利技术的一具体例，l-谷氨酸的生产能力得到提高的棒状杆菌属(corynebacterium sp.)突变株可以是与亲本菌株相比，柠苹酸合酶(citramalatesynthase)的活性弱化或者失活的菌株。
10、在本专利技术中，“活性弱化”是指细胞内的柠苹酸合酶的酶活性程度与野生型菌株或转变前的菌株等亲本菌株相比减少的情况。所述弱化是包括以下情况的概念：通过编码酶的基因的突变等，酶本身的活性与原始微生物具有的酶的活性相比减少的情况，以及通过阻碍编码它的基因的转录(transcription)或者阻碍翻译(translation)等，上述酶的表达水平下降，细胞内的整体酶活性程度与野生型菌株或转变前的菌株相比低的情况，也包括它们组合的情况。此外，在本专利技术中，“失活”是指编码柠苹酸合酶的基因的表达与野生型菌株或者转变前的菌株相比，完全不进行表达或者即使进行表达也不具有其活性的状态。
11、根据本专利技术的一具体例，柠苹酸合酶的酶活性的弱化或者失活可以通过适用该领域中众所周知的各种方法来实现。例如，有如下方法：利用以包括上述酶的活性被完全去除的情况在内的使上述酶的活性减少的方式进行突变的基因替换染色体上的编码上述酶的基因的方法；向编码上述酶的染色体上的基因的表达调控序列(例如启动子)引入突变的方法；将编码上述酶的基因的表达调控序列替换为活性弱或者无活性的序列的方法；使编码上述酶的染色体上的基因的整体或者部分缺失的方法；引入与上述染色体上的基因的转录体互补结合而阻碍从上述mrna到酶的翻译的反义寡核苷酸(例如反义rna)的方法；在编码上述酶的基因的sd序列前端人为性地添加与sd序列互补的序列而形成二级结构物，从而使核糖体(ribosome)不能附着的方法；以及以逆转录的方式将启动子添加于相应序列的orf(开放阅读框，open reading frame)的3'末端的rte(逆转录工程，reverse transcriptionengineering)方法等，也可以通过它们的组合来实现，但并不限定于此。
12、根据本专利技术的一具体例，柠苹酸合酶可以通过leua(2-异丙基苹果酸合酶，2-isopropylmalate synthase)基因而进行编码。
13、在本专利技术中，已知leua(2-异丙基苹果酸合酶，2-isopropylmalate synthase)基因与cima(柠苹酸合酶，citramalate synthase)基因同源性高，在棒状杆菌属菌株中起到柠苹酸合酶的作用。根据本专利技术的一具体例，上述leua基因由seq id no:14的核苷酸序列构成。
14、根据本专利技术的一具体例，柠苹酸合酶的活性弱化或者失活可以是编码柠本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于产生L-谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)突变株，其中柠苹酸合酶的活性弱化或者失活，
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌突变株，其中，所述柠苹酸合酶通过2-异丙基苹果酸合酶(leuA)基因进行编码。
3.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌突变株，其中，所述另外的突变通过使选自由SEQ ID NO:15表示的YggB蛋白质的氨基酸序列中的作为93号氨基酸的亮氨酸和作为109号氨基酸的亮氨酸中的一种以上的亮氨酸置换为丙氨酸而引起。
4.一种L-谷氨酸的制造方法，所述方法包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种用于产生l-谷氨酸的谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium glutamicum)突变株，其中柠苹酸合酶的活性弱化或者失活，
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒状杆菌突变株，其中，所述柠苹酸合酶通过2-异丙基苹果酸合酶(leua)基因进行编码。
3.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：金贤英，李善熙，金玄浩，曹永一，尹炯燮，金硕洙，
申请(专利权)人：大象株式会社，
类型：发明
国别省市：
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