【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫抑制剂霉酚酸的生物合成，具体涉及霉酚酸及其衍生物的一种体外酶法合成方法。
技术介绍
1、霉酚酸(mycophenolic acid，简称mpa，化学结构见图1)，常见由短密青霉等青霉属菌株产生的一类聚酮化合物，被用作降低器官移植之后的免疫排斥反应、治疗自身免疫性疾病等，是应用最广泛的免疫抑制剂之一。
2、霉酚酸的合成策略包括化学合成与生物合成两种方式。在化学合成领域，文献报道了12条化学合成路径，但因霉酚酸结构中特有的芳香环六取代基团，造成化学合成过程步骤冗长、得率低，严重限制了化学合成方法的工业化应用。目前，霉酚酸的获取主要依赖于传统的真菌液体深层发酵。而在基因和酶学层面上，霉酚酸的生物合成基因簇和前体合成途径获得初步的阐述，发现了其基于聚酮合酶的骨架合成和基于氧化降解的侧链产生过程。但其侧链氧化降解过程和催化酶未获得解析和阐明，造成真菌菌株遗传改造的盲目性和不确定性。
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种免疫抑制剂霉酚酸及其衍生物的酶法合成方法，即利用多酶多循环的级联反应策略，催化底物4-二烯癸酸-3-羟基-5-羟甲基-6-甲基苯酞(mfdhmp-3c)或4-二烯癸酸-3,5-二羟基-6-甲基苯酞(fdhmp-3c)转化为霉酚酸及其衍生物。
2、本专利技术首先提供一种用于将4-二烯癸酸-3-羟基-5-羟甲基-6-甲基苯酞fdhmp-3c或4-二烯癸酸-3,5-二羟基-6-甲基苯酞mfdhmp-3c为底物催化合成dmmpa-coa或
3、更进一步的，所述的多酶组合还包含有mpah'(辅酶a水解酶，seq id no:7)和mpag'(氧甲基转移酶，seq id no:8)；
4、本专利技术还提供所述的多酶组合的一种用途，是催化4-二烯癸酸-3-羟基-5-羟甲基-6-甲基苯酞fdhmp-3c或4-二烯癸酸-3,5-二羟基-6-甲基苯酞mfdhmp-3c为底物催化合成霉酚酸；
5、本专利技术还提供一种催化4-二烯癸酸-3-羟基-5-羟甲基-6-甲基苯酞fdhmp-3c或4-二烯癸酸-3,5-二羟基-6-甲基苯酞mfdhmp-3c为底物催化合成霉酚酸mpa的方法，其中以4-二烯癸酸-3-羟基-5-羟甲基-6-甲基苯酞fdhmp-3c或4-二烯癸酸-3,5-二羟基-6-甲基苯酞mfdhmp-3c为底物，经过pbacl75(酰基辅酶a连接酶，seq id no:1)、pbacox323(fad依赖的氧化酶，seq id no:2)、pbdecr799(2，4-二烯酰辅酶a还原酶，seq id no:3)、pbeci1007(烯酰辅酶a异构酶，seq id no:4)、pbech1071(具有水合酶和脱氢酶功能的双功能酶，seq idno:5)和pbkt298(硫解酶，seq id no:6)催化生成mfdhmp-d3-coa或fdhmp-d3-coa；
6、更进一步的，所述的方法以mfdhmp-d3-coa或其脱甲基化产物fdhmp-d3-coa为底物，经过pbacox323(fad依赖的氧化酶，seq id no:2)、pbech1071(具有水合酶和脱氢酶功能的双功能酶，seq id no:5)、pbkt298(硫解酶，seq id no:6)催化生成霉酚酸辅酶a(mpa-coa)或脱甲基霉酚酸辅酶a(dmmpa-coa)。
7、更进一步，所述的方法，从dmmpa-coa到过程由氧甲基转移酶mpag'，mpa-coa水解产生mpa过程由辅酶a水解酶mpah'负责催化。
8、本专利技术首次通过体外酶法实现了从mfdhmp-3c或fdhmp-3c合成mpa的过程，阐明了霉酚酸完整的合成途径和催化酶的催化顺序。
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1.一种多酶组合，其特征在于，所述的多酶组合包含有酰基辅酶A连接酶、FAD依赖的氧化酶、2，4-二烯酰辅酶A还原酶、烯酰辅酶A异构酶、具有水合酶和脱氢酶功能的双功能酶和硫解酶。
2.如权利要求1所述的多酶组合，其特征在于，所述的酰基辅酶A连接酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，FAD依赖的氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；2，4-二烯酰辅酶A还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:3；烯酰辅酶A异构酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:4；具有水合酶和脱氢酶功能的双功能酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:5；硫解酶的氨基酸序列为SEQ IDNO:6。
3.如权利要求1所述的多酶组合，其特征在于，所述的多酶组合还包含有辅酶A水解酶和氧甲基转移酶。
4.如权利要求3所述的多酶组合，其特征在于，所述的辅酶A水解酶的氨基酸序列为SEQID NO:7，氧甲基转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:8。
5.权利要求1-4任一项所述的多酶组合在以4-二烯癸酸-3-羟基-5-羟甲基-6-甲基苯酞FDHMP-3C或4-二烯癸酸-3,5-
6.一种合成霉酚酸MPA的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求3所述的多酶组合以4-二烯癸酸-3-羟基-5-羟甲基-6-甲基苯酞FDHMP-3C或4-二烯癸酸-3,5-二羟基-6-甲基苯酞MFDHMP-3C为底物，催化生成霉酚酸MPA中的应用。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法中，以酰基辅酶A连接酶、FAD依赖的氧化酶、2，4-二烯酰辅酶A还原酶、烯酰辅酶A异构酶、具有水合酶和脱氢酶功能的双功能酶和硫解酶催化4-二烯癸酸-3-羟基-5-羟甲基-6-甲基苯酞FDHMP-3C或4-二烯癸酸-3,5-二羟基-6-甲基苯酞MFDHMP-3C来生成MFDHMP-d3-CoA或FDHMP-d3-CoA。
8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法中，以MFDHMP-d3-CoA或FDHMP-d3-CoA为底物，经过FAD依赖的氧化酶、具有水合酶和脱氢酶功能的双功能酶和硫解酶催化生成霉酚酸辅酶A或脱甲基霉酚酸辅酶A。
9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的方法中，以霉酚酸辅酶A或脱甲基霉酚酸辅酶A作为底物，由辅酶A水解酶和氧甲基转移酶催化生成霉酚酸MPA。
10.一种工程菌株，其特征在于，所述的工程菌株用于重组表达权利要求1-4任一项所述的多酶组合中的蛋白酶。
...【技术特征摘要】
1.一种多酶组合，其特征在于，所述的多酶组合包含有酰基辅酶a连接酶、fad依赖的氧化酶、2，4-二烯酰辅酶a还原酶、烯酰辅酶a异构酶、具有水合酶和脱氢酶功能的双功能酶和硫解酶。
2.如权利要求1所述的多酶组合，其特征在于，所述的酰基辅酶a连接酶的氨基酸序列为seq id no:1，fad依赖的氧化酶的氨基酸序列为seq id no:2；2，4-二烯酰辅酶a还原酶的氨基酸序列为seq id no:3；烯酰辅酶a异构酶的氨基酸序列为seq id no:4；具有水合酶和脱氢酶功能的双功能酶的氨基酸序列为seq id no:5；硫解酶的氨基酸序列为seq idno:6。
3.如权利要求1所述的多酶组合，其特征在于，所述的多酶组合还包含有辅酶a水解酶和氧甲基转移酶。
4.如权利要求3所述的多酶组合，其特征在于，所述的辅酶a水解酶的氨基酸序列为seqid no:7，氧甲基转移酶的氨基酸序列为seq id no:8。
5.权利要求1-4任一项所述的多酶组合在以4-二烯癸酸-3-羟基-5-羟甲基-6-甲基苯酞fdhmp-3c或4-二烯癸酸-3,5-二羟基-6-甲基苯酞mfdhmp-3c为底物，催化生成霉酚酸mpa中的应用。
6.一种合成霉酚酸mpa的方法，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：张伟，范保强，李盛英，杨超凡，刘一诺，迟路坪，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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