【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程，更具体的说是涉及一种crispr-cas12a基因编辑系统及应用。
技术介绍
1、自从dna双螺旋发现以来，许多研究员一直在研究位点特异性改变的可能性，随着酵母中的基因替换拉开了基因编辑的序幕，1987年一个日本科学家在大肠杆菌一个终止密码子之后发现一个间隔开来的重复序列，而后命名为crispr规律成簇的间隔短回文重复序列clustered regularly interspaced short palindromic repeat/associated。功能不为人知，1990-2000年随着测序技术的发展在许多细菌中都发现了相似的序列，从而有许多不同的功能猜测。在同一时期锌指核酸酶介导的基因编辑技术也得到了迅速的发展。2007年science上发表了酿脓链球菌中的crispr序列，他们把人工设计的crispr序列植入到嗜热链球菌的基因组中，这段序列是针对一种之前不能抵抗的噬菌体，发现整合后的新菌株可以抵御这种原来不能抵御的噬菌体。从而将crispr系统与细菌免疫系统联系在一起，之后类转录激活因子效应物核酸酶一夜之间展现出了要替代锌指核酸酶成为新的基因编辑工具的趋势，而后11、12年发现类型二的crispr-cas系统是通过rna引导cas蛋白靶向dna的，2013年实现了cas9-rna在真核生物中的基因编辑从而将crispr技术推向了高潮，2020年因为jennifera.doudna和emmanuelle charpentier发现crispr系统获得了诺贝尔化学奖。
2、crispr系
3、在细菌的免疫系统中是依靠cas操纵子进行的，细菌可以将外源dna切割整合成crispr序列，cas操纵子的crispr序列进行转录形成前体crrna，tracrrna与前体crrna结合在cas蛋白和rnaseⅲ的作用下进行加工修饰形成sgrna，sgrna与cas核酸酶结合形成rnp复合物，而后识别pam序列与目标靶位点结合，cas核酸酶中的两个结构域对靶点进行切割使dna断裂，通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复，造成基因的定点突变。crispr/cas系统只需要一个sgrna和cas核酸酶就可以进行dna的定点编辑。
4、随着基因编辑技术的发展，crispr-cas12a已经应用于多种丝状真菌中，例如在里氏木霉、嗜热毁丝霉、稻瘟病菌、烟曲霉、黑曲霉、构巢曲霉等都得到了广泛的应用而在灰葡萄孢中还未进行应用。
5、灰葡萄孢是多种植物的病原菌，可危害到果蔬和园艺作物造成巨大的经济损失，因此灰葡萄孢致病相关基因的功能与机制研究也变的尤为重要。
6、因此，提供一种crispr-cas12a基因编辑系统及其在基因编辑灰葡萄孢中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种crispr-cas12a基因编辑系统及应用。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种crispr-cas12a基因编辑系统，所述crispr-cas12a基因编辑系统包括1307-2hyg-lbcas12a-crrna质粒；
4、所述1307-2hyg-lbcas12a-crrna质粒包含1307-flag载体、hyg基因、cas12a基因、crrna序列；所述1307-flag表达载体多克隆位点插入了trpc启动子启动的hyg表达盒，在hyg表达盒前方插入了带有tef启动子cas12a基因表达盒、在cas12a基因表达盒前方通过基因合成的方式插入了带u3启动子启动的crrna表达盒。
5、进一步的，编码所述1307-flag载体序列如seq id no:1所示。
6、进一步的，编码所述hyg基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
7、进一步的，编码所述cas12a基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。
8、进一步的，编码所述crrna的核苷酸序列如seq id no:4所示。
9、一种crispr-cas12a基因编辑系统在基因编辑灰葡萄孢中的应用，所述基因编辑方法包括以下步骤：
10、1)将所述crispr-cas12a基因编辑系统中的1307-2hyg-lbcas12a-crrna质粒导入灰葡萄孢中，使得1307-2hyg-lbcas12a-crrna质粒上的hyg基因、cas12a基因表达、crrna转录加工修饰成茎环结构；
11、2)cas12a蛋白会识别所述茎环结构与crrna形成复合物，所述复合物会靶向编辑基因并锚定在灰葡萄孢需要编辑的基因上；
12、3)锚定后cas12a蛋白会发挥dna切割活性，对灰葡萄孢的dna进行定点切割，产生dsb断裂，此时灰葡萄孢会发挥自身的修复系统对其进行nhej修复，形成敲除突变体，从而完成对灰葡萄孢的基因编辑过程；
13、4)对突变体进行验证及表型和致病力分析。
14、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
15、1、本专利技术可以对灰葡萄孢进行定点基因编辑。
16、2、本专利技术所制备的载体将cas12a蛋白与crrna序列构建于同一载体转入灰葡萄孢中，流程进行缩减。
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1.一种CRISPR-Cas12a基因编辑系统，其特征在于，所述CRISPR-Cas12a基因编辑系统包括1307-2hyg-LbCas12a-crRNA质粒；
2.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，编码所述1307-flag载体序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，编码所述hyg基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，编码所述Cas12a基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，编码所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.权利要求1所述一种CRISPR-Cas12a基因编辑系统在基因编辑灰葡萄孢中的应用，其特征在于，所述基因编辑方法包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种crispr-cas12a基因编辑系统，其特征在于，所述crispr-cas12a基因编辑系统包括1307-2hyg-lbcas12a-crrna质粒；
2.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，编码所述1307-flag载体序列如seq id no:1所示。
3.根据权利要求1所述的基因编辑系统，其特征在于，编码所述hyg基因的核苷酸序列如seq id no:2...
【专利技术属性】
技术研发人员：邢继红，杨文皓，张康，曹宏哲，董金皋，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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