【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一组可降解聚乙烯塑料的祖先漆酶，属于生物。
技术介绍
1、聚乙烯(polyethylene，pe)是一种热塑性塑料，由乙烯分子聚合而成。依聚合方法、分子量和侧链结构差异，pe可分为高密度聚乙烯(hdpe)、低密度聚乙烯(ldpe)及线性低密度聚乙烯(lldpe)。pe应用广泛，但同时也产生了大量的pe塑料废弃物。目前塑料废弃物的处理方法主要包括填埋、焚烧、机械回收和化学回收，但通常会导致环境污染，并存在成本高昂和回收塑料重复性差等问题。目前已报到多种可降解pe塑料的微生物，它们通过胞外酶将pe聚合物分解成能被细胞利用的低聚物，进入微生物体内后进一步代谢生成co2和h2o。与其它处理方法相比，生物降解塑料具有生态友好、成本低廉等优势，具有良好的应用前景。转录组学分析和体外验证表明，微生物胞外参与pe降解酶包括漆酶、脂肪酶和其他氧化酶。
2、pe材料有着致密的空间结构，现有技术中报道了经uv或者高温处理后，部分真菌漆酶和细菌漆酶balac和bslac在添加介体条件下可以降解pe塑料，预处理及介体添加程序复杂，不利于应用。近来，也有研究发现pslac(psychrobacter sp.nj228)、lysinibaccillus fusiformis(lflac3)、lmco2 and lmco3等细菌漆酶，对于未经预处理的pe塑料在无介体条件下也可以部分降解(computer-aided discovery of a novelthermophilic laccase for low-density pol
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的不足，本专利技术通过祖先序列重建，获得了高pe降解效率的突漆酶蛋白，本专利技术获得的蛋白并不来自自然界已有蛋白，而是源于祖先序列重建方法获得的，本专利技术获得的突变体在pe降解方面存在着良好的应用前景。
2、本专利技术提供了一种漆酶蛋白，所述漆酶蛋白为以下(a)-(c)任一所示：
3、(a)氨基酸序列如seq id no.1所示的漆酶蛋白anc41；
4、(b)氨基酸序列如seq id no.2所示的漆酶蛋白anc42；
5、(c)氨基酸序列如seq id no.3所示的漆酶蛋白anc43。
6、本专利技术还提供了编码所述漆酶蛋白的基因。
7、本专利技术还提供了携带所述基因的重组质粒。
8、本专利技术还提供了表达所述漆酶蛋白的重组细胞。
9、在一种实施方式中，所述重组细胞以大肠杆菌为宿主。
10、在一种实施方式中，所述重组细胞是以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，以pet系列质粒为表达载体。
11、本专利技术还提供了一种生产漆酶蛋白的方法，所述方法包括：
12、(1)将所述重组大肠杆菌接种至培养基中，加入cu2+和iptg进行诱导培养；
13、(2)收集步骤(1)所得发酵液，分离获得细胞，破碎细胞，得到漆酶蛋白。
14、在一种实施方式中，所述步骤(1)的培养温度为于30～37℃。
15、在一种实施方式中，所述步骤(1)的诱导温度为15-30℃，优选为20℃。
16、在一种实施方式中，所述步骤(1)中诱导时间为10-30h，优选为24h。
17、在一种实施方式中，所述步骤(1)中的培养基包括但不限于lb培养基。
18、在一种实施方式中，所述步骤(1)中的cu2+终浓度为0.1-2mmol/l，iptg终浓度为0.01-0.5mmol/l；优选为cu2+终浓度为1mmol/l，iptg浓度为0.1mmol/l。
19、在一种实施方式中，所述步骤(1)诱导条件优选为20℃诱导24h。
20、在一种实施方式中，所述步骤(2)中破碎优选为高压匀质破碎。
21、在一种实施方式中，还对上述方法所得漆酶蛋白进行了纯化，所述纯化为ni2+-sepharose亲和柱纯化。
22、本专利技术还提供了一种pe降解方法，所述方法为将上述漆酶蛋白与聚乙烯接触，降解聚乙烯。
23、在一种实施方式中，所述聚乙烯经过了预处理，所述预处理包括将聚乙烯以乙醇浸泡。
24、在一种实施方式中，所述降解的反应ph为3.0-7.0。
25、本专利技术还提供了所述漆酶蛋白，或所述重组细胞，或所述方法在pe降解中的应用。
26、有益效果：
27、(1)本专利技术通过祖先序列重建，得到了anc41,anc42,anc43所示的全新的漆酶蛋白，其氨基酸序列分别如seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3所示。本专利技术得到的漆酶蛋白为通过祖先序列重建获得的新的蛋白。
28、(2)本专利技术构建得到的漆酶蛋白，可以高效降解pe，经本专利技术漆酶蛋白水解后，pe的羰基吸光度达到了1.61％以上，羟基吸光度达到了0.60％以上，pe膜表面原子比率％(c/o)达到了98.45/1.55以上，pe膜褶皱原子比率％(c/o)达到了98.00/2.00以上，具体降解效果如表1、表2所示。
29、(3)本专利技术得到的漆酶蛋白，显示出了良好的pe降解性能，并且可以处理不经高温处理的pe材料，且反应无需添加介体，更适于工业化应用。
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1.一种漆酶蛋白，其特征在于，为(a)～(c)任一所示：
2.编码权利要求1所述漆酶蛋白的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。
4.表达权利要求1所述漆酶的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，以pET系列质粒为表达载体。
6.一种生产漆酶蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养基包括LB培养基。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的温度为15-30℃。
9.一种聚乙烯降解方法，其特征在于，将权利要求1所述漆酶蛋白与聚乙烯接触，降解聚乙烯。
10.权利要求1所述漆酶蛋白，或权利要求4或5所述重组细胞，或权利要求9所述方法在聚乙烯降解中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种漆酶蛋白，其特征在于，为(a)～(c)任一所示：
2.编码权利要求1所述漆酶蛋白的基因。
3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。
4.表达权利要求1所述漆酶的重组细胞。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以大肠杆菌bl21(de3)为宿主，以pet系列质粒为表达载体。
6.一种生产漆酶蛋白的方法，其特征在于，所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘松，曾波，崔世修，堵国成，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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