【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，涉及一种通过mstn和fgf5双基因编辑抑制绵羊成肌细胞二次融合的方法与应用。
技术介绍
1、肌肉生长抑制素(myostatin,mstn)又被称为生长分化因子-8(growthdifferentiation factor-8,gdf-8)，是转化生长因子-β(transforming growth factor-β,tgf-β)超家族的成员，其通过自分泌和旁分泌的方式负调控骨骼肌的生长发育。作为一种分泌蛋白，mstn需要通过一系列的级联反应将其信号传递至细胞核。mstn主要利用ii型激活素a受体(activin receptor kinase ii-a,actriia)和actriib以及i型激活蛋白受体样激酶4(activin receptor-like kinase 4,alk4)和alk5通过smad2/3引起信号转导。除了经典的smads信号转导途径外，mstn也可依赖于丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,mapk)途径进行信号传递。例如，mstn可通过tak1-mkk6途径激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 mapk)，并抑制c2c12成肌细胞的增殖。mstn也可通过结合其actriib受体诱导下游jnk信号的激活，并进一步抑制c2c12成肌细胞的增殖与分化。此外，mstn也可通过抑制akt/torc1/p70s6k信号传导抑制肌源性分化和肌管大小。
2、成纤维
3、长期以来，ca2+一直被认为是哺乳动物肌肉融合的调节因子。内质网的短暂ca2+耗竭与成肌细胞分化和融合有关，ca2+敏感转录因子nfatc2可介导成肌细胞募集和肌管扩张。最近研究显示，胞内ca2+水平升高对成肌细胞融合至关重要，新生肌管中的ca2+信号先于肌管快速生长阶段，表明早期肌管中内质网释放的ca2+可能促进成肌细胞二次融合和肌管扩张。然而，导致ca2+介导的成肌细胞融合的信号级联仍不清楚。细胞内ca2+水平通过各种ca2+和电压门控通道调节，包括但不限于兰尼碱受体(ryanodine receptors,ryr)。ryr是肌浆网的主要ca2+释放通道，其调节ca2+外流至细胞质。camkii是钙/钙调蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶家族的成员，camkiiδ、camkiiγ和camkiiβ是骨骼肌中表达的主要亚型。
4、在哺乳动物中，骨骼肌卫星细胞经激活、增殖、分化为成肌细胞(myoblasts)，成肌细胞再经终末分化、融合和肌核重排形成成熟肌管(myotubes)，其中成肌细胞融合是一个两阶段过程。在第一阶段，成肌细胞与成肌细胞融合形成初级多核肌管。在第二阶段，额外的成肌细胞与已经形成的多核肌管细胞融合，这一过程通常被称为成肌细胞的二次融合。成肌细胞二次融合增加了单个肌管中的细胞核数，使肌纤维体积增加，但并不影响肌纤维数量，表现为肌纤维肥大。反之，抑制成肌细胞二次融合则有利于形成更多的初级多核肌管，使肌纤维数量增加并导致肌纤维增生表型，从而有利于培育肌纤维增生型高产肉性能绵羊。总之，成肌细胞的二次融合是骨骼肌卫星细胞成肌分化形成成熟肌管过程中重要的环节。因此，需要寻找调控该重要环节的靶点。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是提供一种通过mstn和fgf5双基因编辑抑制绵羊成肌细胞二次融合的方法与应用。
2、第一方面，本专利技术提供了以mstn基因为基因编辑靶标的物质和以fgf5基因为基因编辑靶标的物质的应用在如下任一种的应用：
3、1)制备抑制成肌细胞二次融合的产品；
4、2)制备二次融合能力降低的细胞；在本专利技术的实施例中具体为来源于mstn基因和fgf5基因编辑的动物的骨骼肌细胞，在本专利技术的实施例中mstn基因和fgf5基因编辑的动物为mstn基因和fgf5基因编辑均纯合(mstn-/-和fgf5-/-)绵羊(命名为mf-/-绵羊)或mstn基因和fgf5基因编辑杂合(mstn+/-和fgf5+/-)绵羊(命名为mf+/-绵羊)；
5、3)制备降低肌管融合指数的产品；
6、4)制备降低单个肌管中的细胞核数的产品；
7、5)制备抑制骨骼肌卫星细胞中胞内ca2+的释放的产品；
8、6)制备抑制骨骼肌卫星细胞中camkiiα/δ的表达的产品；
9、7)制备抑制成肌细胞融合相关基因的表达的产品；在本专利技术的实施例中具体为mymk、mymx和/或rac1；
10、8)培育高产肉性能动物(具体为肌纤维增生型高产肉性能动物)。
11、上文所述应用中，所述动物为哺乳动物，
12、进一步地，所述动物为绵羊。
13、第二方面，本专利技术提供了一种制备细胞模型的方法，包括如下步骤：利用基因编辑制备mstn基因和fgf5基因双等位基因编辑的动物(mstn-/-和fgf5-/-)，再与野生型动物配种，生产子代，选取mstn基因和fgf5基因编辑纯合(mstn-/-和fgf5-/-)的动物或mstn基因和fgf5基因编辑杂合(mstn+/-和fgf5+/-)的动物，作为目标动物，分离获取所述目标动物的骨骼肌卫星细胞，即为细胞模型；
14、所述细胞模型的用途为筛选抑制成肌细胞二次融合的药物。
15、第三方面，本专利技术提供了第二方面所述方法制备的细胞模型在筛选药物中的应用；所述药物为抑制成肌细胞二次融合的药物。
16、第四方面，本专利技术提供了一种制备动物模型的方法，包括如下步骤：利用基因编辑制备mstn基因和fgf5基因双等位基因编辑的动物(mstn-/-和fgf5-/-)，再与野生型动物配种，生产子代，选取mstn基因和fgf5基因编辑纯合(mstn-/-和fgf5-/-)的动物或mstn基因和fgf5基因编辑杂合(mstn+/-和fgf5+/-)的动物，作为目标动物，即为动物模型；所述动物模型的用途为筛选抑制成肌细胞二次融合的药物。
17、第五方面，本专利技术提供了第四方面所述方法制备的动物模型在筛选药物中的应用；所述药物为抑制成肌细胞二次融合的药物。
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【技术保护点】
1.以MSTN基因为基因编辑靶标的物质和以FGF5基因为基因编辑靶标的物质的应用在如下任一种的应用：
2.一种制备细胞模型的方法，包括如下步骤：利用基因编辑制备MSTN基因和FGF5基因双等位基因编辑的动物，再与野生型动物配种，生产子代，选取MSTN基因和FGF5基因编辑纯合的动物或MSTN基因和FGF5基因编辑杂合的动物，作为目标动物，分离获取所述目标动物的骨骼肌卫星细胞，即为细胞模型；
3.权利要求2所述方法制备的细胞模型在筛选药物中的应用；所述药物为抑制成肌细胞二次融合的药物。
4.一种制备动物模型的方法，包括如下步骤：利用基因编辑制备MSTN基因和FGF5基因双等位基因编辑的动物，再与野生型动物配种，生产子代，选取MSTN基因和FGF5基因编辑纯合的动物或MSTN基因和FGF5基因编辑杂合的动物，作为目标动物，即为动物模型；所述动物模型的用途为筛选抑制成肌细胞二次融合的药物。
5.权利要求4所述方法制备的动物模型在筛选药物中的应用；所述药物为抑制成肌细胞二次融合的药物。
6.根据权利要求1或5所述的应用或权利要求
...【技术特征摘要】
1.以mstn基因为基因编辑靶标的物质和以fgf5基因为基因编辑靶标的物质的应用在如下任一种的应用：
2.一种制备细胞模型的方法，包括如下步骤：利用基因编辑制备mstn基因和fgf5基因双等位基因编辑的动物，再与野生型动物配种，生产子代，选取mstn基因和fgf5基因编辑纯合的动物或mstn基因和fgf5基因编辑杂合的动物，作为目标动物，分离获取所述目标动物的骨骼肌卫星细胞，即为细胞模型；
3.权利要求2所述方法制备的细胞模型在筛选药物中的应用；所述药物为抑制成肌细胞二次融合的药物。...
【专利技术属性】
技术研发人员：连正兴，陈明明，李岩，于坤，赵越，刘国世，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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