【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程，具体涉及一种高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、d-阿拉伯糖醇是12种高附加值平台化合物之一，具有低热量、抗龋齿、在体内代谢不影响胰岛素水平等特点，在食品、医药和化工领域具有广阔的应用前景，其市场需求逐年增加。但目前d-阿拉伯糖醇的生产方法中，物理提取法效率低，且存在与粮争地的弊端；化学合成又存在环境污染、成本高、分离纯化难等诸多问题。而生物法以微生物细胞为工厂，利用体内代谢途径负载的酶系统，可催化合成一系列天然产物，具有更高的安全性、环境友好性和可持续性，是当下生产食用营养成分、活性药物及中间体、大宗化学品颇受青睐的主流方法。
2、微生物法生产d-阿拉伯糖醇的关键取决于菌株的自身生产性能，尽管国内外学者围绕产d-阿拉伯糖醇优势菌株的筛选、发酵优化结合物理/化学诱变、适应性进化、基因组改组等技术以获得遗传稳定性良好且生产性能强的菌株方面做了大量努力，但是d-阿拉伯糖醇产量仍达不到工业化生产的需求。因此需构建一种相比现有菌株生产性能大幅度提高的基因工程菌。
3、鲁氏酵母(zygosaccharomyces rouxii)为传统酿造专用酵母，因其独特的胁迫耐受性，较高的生长密度，高通量的戊糖磷酸途径，以及较强的初始d-阿拉伯糖醇合成能力，是生产d-阿拉伯糖醇的潜在理想底盘。随着生物智造技术的发展，集结代谢途径工程和辅酶工程，对z.rouxii酵母底盘细胞的代谢网络进行针对性的合理改造和平衡调控，构建强健的z.rouxii酵母细胞工厂，并优化细胞工厂发酵
技术实现思路
1、针对现有技术中存在的一些不足，本专利技术提供了一种高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌及其构建方法和应用；本专利技术以鲁氏酵母为出发菌，采用合成生物学技术，集结代谢途径工程和辅酶工程构建了一株d-阿拉伯糖醇生产性能大幅提升的鲁氏酵母工程菌；所述鲁氏酵母工程菌解决了现有技术中生产d-阿拉伯糖醇的菌株存在生产性能低下、d-阿拉伯糖醇产率不高、下游分离纯化难等突出问题；所述鲁氏酵母工程菌在发酵葡萄糖高产d-阿拉伯糖醇中具有很好的应用。
2、为了解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术手段：
3、本专利技术首先提供了一种高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌，包含：
4、(1)核苷酸序列如seq id no:1所示的表达质粒pgap-xylb-ptef1-rpe-ppgk1-pardh4；和/或
5、(2)核苷酸序列如seq id no:2所示的表达质粒pgap-pnta-ptef1-pntb；和/或
6、(3)核苷酸序列如seq id no:3所示的rnai反向双元启动子沉默质粒ptesh-gpi-dual。本专利技术还提供了上述高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
7、(1)分别将表达质粒pgap-xylb-ptef1-rpe-ppgk1-pardh4和pgap-pnta-ptef1-pntb线性化处理；
8、(2)将线性化处理后的表达质粒pgap-xylb-ptef1-rpe-ppgk1-pardh4和pgap-pnta-ptef1-pntb，以及rnai反向双元启动子沉默质粒ptesh-gpi-dual通过电击法转入鲁氏酵母感受态细胞，并通过zeocinr、g418r和hygr进行筛选，验证，得到所述高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌。
9、优选地，步骤(1)中，所述表达质粒pgap-xylb-ptef1-rpe-ppgk1-pardh4的核苷酸序列如seq id no:1所示；
10、所述表达质粒pgap-xylb-ptef1-rpe-ppgk1-pardh4的构建步骤包括：
11、s1.pcr扩增鲁氏酵母内源基因核酮糖-5p-异构酶基因(rpe)和木酮糖激酶基因(xylb)，然后分别与线性化质粒骨架pgap组装，得到过渡质粒pgap-rpe和pgap-xylb；
12、s2.将得到的过渡质粒pgap-rpe中的启动子替换为ptef1，得到ptef1-rpe，然后将ptef1-rpe与pgap-xylb无缝克隆，得到质粒pgap-xylb-ptef1-rpe；
13、s3.pcr扩增毕赤酵母来源的基因pardh4，构建pardh4表达盒，将pardh4表达盒与线性化pgap-xylb-ptef1-rpe组装，得到重组表达质粒pgap-xylb-ptef1-rpe-ppgk1-pardh4。
14、优选地，步骤(1)中，表达质粒pgap-pnta-ptef1-pntb的序列如seq id no:2所示；
15、所述表达质粒pgap-pnta-ptef1-pntb的构建步骤包括：
16、pcr扩增e.coli w3110来源的膜结合转氢酶基因pntab基因得到pnta和pntb，依次通过反向pcr替换质粒pgap-xylb-ptef1-rpe中的xylb和rpe基因，获得表达质粒pgap-pnta-ptef1-pntb。
17、优选地，步骤(1)中，所述rnai反向双元启动子沉默质粒ptesh-gpi-dual的核苷酸序列如seq id no:3所示；
18、所述rnai反向双元启动子沉默质粒ptesh-gpi-dual的构建步骤包括：
19、a.反向pcr获得ptef1-rpe质粒骨架，并将其与鲁氏酵母的psr1复制子连接，然后替换zeocinr为hygr，构建鲁氏酵母游离表达质粒ptesh；
20、b.扩增启动子ppgk1，将其与线性化的鲁氏酵母游离表达质粒ptesh无缝克隆，得到含双向启动子ptef1和ppgk1的过渡质粒；
21、c.将含双向启动子ptef1和ppgk1的过渡质粒与扩增的葡萄糖-6p-异构酶(gpi)基因保守区连接，得到rnai反向双元启动子沉默质粒ptesh-gpi-dual。
22、优选地，步骤(2)中，所述鲁氏酵母感受态细胞包括野生型z.rouxii st109(zr-st109)，以及zr-w3a和zr-w3ab。
23、本专利技术还提供了上述鲁氏酵母工程菌在生物合成d-阿拉伯糖醇中的应用。
24、优选地，所述应用为发酵葡萄糖生产d-阿拉伯糖醇。
25、本专利技术还提供了一种生物合成d-阿拉伯糖醇的方法，包括：将上述高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌接种至以葡萄糖为底物的发酵培养基中，发酵得到d-阿拉伯糖醇。
26、优选地，所述d-阿拉伯糖醇的分离纯化步骤为：z.rouxii工程菌发酵液离心去除菌体，将上清液脱色、超滤、浓缩并除去副产物，然后在低温条件下结合乙醇沉淀诱导d-阿拉伯糖醇结本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种高产D-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌，其特征在于，所述鲁氏酵母工程菌包含：
2.权利要求1所述的高产D-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括：
3.根据权利要求2所述的高产D-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表达质粒pGAP-xylb-pTEF1-rpe-pPGK1-Pardh4的核苷酸序列如SEQIDNo:1所示；
4.根据权利要求2所述的高产D-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表达质粒pGAP-pntA-pTEF1-pntB的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；
5.根据权利要求2所述的高产D-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述RNAi反向双元启动子沉默质粒pTESH-gpi-dual的核苷酸序列如SEQ IDNo:3所示；
6.根据权利要求2所述的高产D-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，所述鲁氏酵母感受态细胞包括野生型Z.rouxii ST109(ZR
7.权利要求1所述的高产D-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌、或权利要求2～6任一项所述方法构建的高产D-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌在生物合成D-阿拉伯糖醇中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用为发酵葡萄糖生产D-阿拉伯糖醇。
9.一种生物合成D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于，包括：将上述高产D-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌接种至以葡萄糖为底物的发酵培养基中，发酵后，经分离纯化得到产物D-阿拉伯糖醇。
10.根据权利要求9所述的生物合成D-阿拉伯糖醇的方法，其特征在于，所纯化步骤为：Z.rouxii工程菌发酵液离心去除菌体，将上清液脱色、超滤、浓缩并除去副产物，然后在低温条件下结合乙醇沉淀诱导D-阿拉伯糖醇结晶并去除副产物甘油，最后干燥得到D-阿拉伯糖醇晶体。
...【技术特征摘要】
1.一种高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌，其特征在于，所述鲁氏酵母工程菌包含：
2.权利要求1所述的高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括：
3.根据权利要求2所述的高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表达质粒pgap-xylb-ptef1-rpe-ppgk1-pardh4的核苷酸序列如seqidno:1所示；
4.根据权利要求2所述的高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述表达质粒pgap-pnta-ptef1-pntb的核苷酸序列如seq id no:2所示；
5.根据权利要求2所述的高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程菌的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述rnai反向双元启动子沉默质粒ptesh-gpi-dual的核苷酸序列如seq idno:3所示；
6.根据权利要求2所述的高产d-阿拉伯糖醇的鲁氏酵母工程...
【专利技术属性】
技术研发人员：齐向辉，李小兰，赵梅，张存胜，陈自卫，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：
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