【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因编辑，具体涉及crispr/cas9 系统介导的斑马鱼 gnai2a基因突变体的构建方法。
技术介绍
1、 gnai2a（ guanine nucleotide binding protein (g protein), alphainhibiting activity polypeptide 2a ）基因位于斑马鱼第 11号染色体上，包含9个外显子和8个内含子，mrna全长2603bp，编码355个氨基酸。 gnai2a 属于小g蛋白家族成员，编码的蛋白质含有鸟嘌呤核苷酸结合位点，包含一个高度保守的gα结构域，具有gtp酶活性。鸟嘌呤核苷酸结合蛋白（g 蛋白）作为各种跨膜信号系统中的调节因子或信号转导因子，参与调节多种细胞生命活动。
2、斑马鱼与人类发育过程中的调控基因、信号转导具有高度同源性，且 gnai2a基因进化上较为保守，研究发现 gnai2a在斑马鱼胚胎发育早期特异性表达。而且，与其他动物模型相比，斑马鱼具有个体小、易于饲养、发育快、繁殖能力强、体外受精、胚胎体外发育模式且胚胎和幼鱼透明等优点。
3、 根据crispr/cas9基因编辑技术原理，在斑马鱼的 gnai2a 基因上设计合适的靶位点，在体外合成的特异性grna（终浓度150 ng/μl
4、 基因打靶技术起源于20世纪80年代，是一种利用同源重组方法改变生物体某一内源基因的遗传学技术，通过对基因组定点修饰来研究基因功能的重要手段，可用于治疗人类的各种遗传性疾病。该技术主要是利用缺失突变、插入突变、基因灭活、染色体大片段删除以及外源基因导入等方式来改变生物体的遗传信息，并且在生殖系中稳定遗传后表达突变性状，从而研究生物体特定基因在生长发育过程中的作用，这类技术手段已成为现代分子生物学的研究热点。传统的基因打靶技术是建立在胚胎干细胞(esc) 和同源重组技术的基础之上，故打靶技术效率极低。2013年初，一种全新的人工核酸内切酶clusteredregularly interspaced short palindromic repeats (crispr)/crispr-associated(cas)9，能更高效且更精确地在生物体基因组中沉默特定基因，且制作简单、成本低，可同时对靶基因上多个位点进行剪切，沉默任意数目的单个基因，但同时该技术存在一定的缺陷，其脱靶率相对较高。
技术实现思路
1、本专利技术为了克服上述技术问题的不足，提供了一种斑马鱼 gnai2a编辑靶位点grna的设计合成及突变体模型建立的方法，设计并合成了靶位点grna，利用crispr/cas9基因编辑技术，繁育筛选出 gnai2a基因突变型纯合斑马鱼。
2、解决上述技术问题的技术方案如下：
3、设计crispr/cas9基因编辑靶位点和鉴定引物
4、在national center for biotechnology information（ncbi）上查询斑马鱼 gnai2a的基因组dna序列，在网站smart（http://smart.embl-heidelberg .de/）上分析其功能结构域 ，根据 crispr/cas9基因编辑技术的原理 ，在chopchop在线网站(https:// /chopchop.cbu.uib.no/)上设计 gnai2a基因的靶位点。靶位点的选择遵循以下标准：靶位点的3’端是ngg结构；靶点的位置在基因的功能结构域内，以确保靶位点碱基的插入或者缺失可以影响 gnai2a基因的结构域，从而改变 gnai2a基因的表达。
5、特异性靶位点pcr 引物如下：
6、 gnai2a grna 1_f（靶位点1正向引物）：
7、5’- taatacgactcactatagctggctcacggtacagcccagttttagagctagaaatagc-3’
8、 gnai2a grna 2_f（靶位点2正向引物）：
9、5’- taatacgactcactatagggacggggagaaagccgccagttttagagctagaaatagc-3’
10、grna scaffold:（共用的反向引物）：
11、gatccgcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac
12、pcr检测引物：
13、 gnai2a grna id f: 5’- gtttgctaaaaattttccgacg -3’
14、 gnai2a grna id r: 5’- acacactttgccaacaaaacac -3’
15、pcr 合成 grna 体外转录模板
16、pcr反应体系：
17、 gnai2a grna 1/2 2μl
18、grna scaffold 2 μl
19、phusion® hot start flex 2 × master mix 25μl
20、ddh2o 20μl
21、总体积 50μl
22、反应程序：
23、98℃ 30s
24、98℃ 10 s 35 cycle
25、65℃ 10 s 35 cycle
26、72℃ 10 s 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.斑马鱼gnai2a基因编辑靶位点gRNA的设计合成及突变体模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的斑马鱼gnai2a基因编辑靶位点gRNA的设计合成方法，其特征在于，步骤（1）中靶位点的选择遵循以下标准：靶位点的3’端是NGG结构；靶点的位置在基因的蛋白编码区或功能结构域内。
3.根据权利要求1所述的斑马鱼gnai2a基因编辑靶位点gRNA的设计合成方法，其特征在于，步骤（3）中所述的PCR扩增实验中所用的PCR酶为高保真DNA聚合酶产品。
4.根据权利要求1所述的斑马鱼gnai2a基因编辑靶位点gRNA的设计合成方法，其特征在于，步骤（4）中所述的体外转录实验中所用的转录酶为快速高效RNA合成酶，且Tip头，EP管均为RNase free产品。
5.根据权利要求1所述的斑马鱼gnai2a突变体模型建立的方法，其特征在于，步骤（6）中斑马鱼gnai2a靶位点有效性鉴定以及基因纯合突变体的繁育方法如下：显微注射36-48hpf的斑马鱼胚胎，进行gnai2a基因敲除效率检测，确定gnai2a基因F0代突变
...【技术特征摘要】
1.斑马鱼gnai2a基因编辑靶位点grna的设计合成及突变体模型建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的斑马鱼gnai2a基因编辑靶位点grna的设计合成方法，其特征在于，步骤（1）中靶位点的选择遵循以下标准：靶位点的3’端是ngg结构；靶点的位置在基因的蛋白编码区或功能结构域内。
3.根据权利要求1所述的斑马鱼gnai2a基因编辑靶位点grna的设计合成方法，其特征在于，步骤（3）中所述的pcr扩增实验中所用的pcr酶为高保真dna聚合酶产品。
4.根据权利...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。