利用CRISPR/Cas9技术敲除克氏原螯虾基因的方法、正反引物和应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，尤其涉及利用CRISPR/Cas9技术敲除克氏原螯虾基因的方法，为了克服虾类基因敲除的困难，及时收集产卵24h以内的胚胎，对注射过程中遇到的受精卵膜软化不同酶、不同浓度时间进行了探索，既保证了受精卵膜软化，又保证胚胎完整性，最终成功将胚胎孵化出小苗。本发明专利技术的该方法用于敲除MSTN基因进而培育高肌肉质量克氏原螯虾，能够导致虾类的肌肉质量增加，提升产量，从而显著提高养殖效率。这一技术的成功应用，或将让养殖户能够在更短时间内实现更高的产量，有助于虾类养殖的工业化发展。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程，尤其涉及利用crispr/cas9技术敲除克氏原螯虾基因的方法。

技术介绍

1、随着crispr/cas9系统研究不断深入，科学家将多个sgrna表达框构建到相应靶点序列，然后将其整合在同一个载体中，从而实现sgrna表达框的共同表达，其高切割活性允许在单个反应中同时靶向单个细胞中的多个dna序列位点，从而敲除多个基因或染色体长片段，实现更灵活和多样化的基因修饰效果。

2、由于克氏原螯虾产卵时间不确定，并且在池塘中是打洞繁殖，难以收集刚产卵的虾，对实验进行增加难度。鱼的胚胎孵化周期较短，而克氏原螯虾周期大约20天左右，并且甲壳类胚胎注射难度大，显微注射针一碰就破裂，对于出现的卵膜硬度处理，需要经过不同酶不同浓度时间处理摸索，注射时常堵针，试剂需常制备，培养周期长，一系列问题导致成功率非常小，时长和难度高于鱼类。

3、基因编辑技术在改良动物表型、加快遗传进程上具有传统育种技术无法比拟的优势。在动物的遗传育种上，基因编辑技术已成功应用于改善多种动物的生长性状和生产性能、提升抗病性，促进了现代种业的创新发展。cri本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种利用CRISPR/Cas9技术敲除克氏原螯虾基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标基因为MSTN基因，所述MSTN基因敲除的靶序列为：

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述惰性染料为苯酚，所述Cas9/gRNA混合物中包含以下浓度的各组分：200-250 ng/μL Cas9蛋白，100-150 ng/μLgRNA，0.05-0.1wt%惰性染料。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述Cas9/gRNA混合物通过0.18-0.22μm过滤膜...

【技术特征摘要】

1.一种利用crispr/cas9技术敲除克氏原螯虾基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标基因为mstn基因，所述mstn基因敲除的靶序列为：

3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述惰性染料为苯酚，所述cas9/grna混合物中包含以下浓度的各组分：200-250 ng/μl cas9蛋白，100-150 ng/μlgrna，0.05-0.1wt%惰性染料。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述cas9/grna混合物通过0.18-0.22μm过滤膜过滤。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（2）中，收集克氏原螯虾受精卵前，将雌雄虾以2-3:1数量比在放有水葫芦的环境中进行配对自然授精，期间控制溶解氧>6....

【专利技术属性】
技术研发人员：王余德，刘少军，李健，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：