【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及与肝脏相关疾病的药物筛选方法，具体地，涉及一种利用具有与肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞、枯否细胞、血管细胞等实际肝组织相似的结构和功能的肝脏类器官的生产方法进行肝相关疾病(如非酒精性脂肪性肝炎)的药物筛选方法。
技术介绍
1、肝脏是一种具备物质代谢、包括胆固醇和胆汁酸在内的多种蛋白质合成、糖原贮积调节、有毒物质分解等多种功能的器官。肝病是韩国国民的五大死亡原因之一，其在社会活动最活跃的40～50岁男性中为主要疾病，发病率仅次于癌症，位居第二位。实际上，韩国在经济合作与发展组织(oecd)国家中，因肝炎、肝癌、肝硬化等肝疾病导致的死亡率最高，每年肝脏疾病的疗养补助支出额达3,550亿韩元，实际人数约达166万人。
2、肝脏是生物体内具有内在再生能力的代表性器官。肝病机制研究、治疗药物开发等研究中广泛使用动物模型或肿瘤源性肝细胞，但由于与人肝细胞相比存在遗传、生理方面的差异及功能限制，迄今为止，体内衍生的初级人类肝细胞(primary humanhepatocytes，phh)被评为最合适的模型。但体内衍生的初级人类肝细胞具有体外培养困难、体外培养时增殖能力和功能性丧失、可用性极为有限等多种局限性。因此，存在需要构建具有稳定的体外增殖能力和高功能性的新型的基于人类细胞的患者定制型肝细胞模型的持续需求。
3、为了克服源于体内的初级人类肝细胞的多种局限性，利用包括胚胎干细胞(embryonic stem cell，esc)、诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell，
4、最近，作为有用的替代性来源，由全能干细胞(psc)生成的肝脏类器官(organoid)备受关注。类器官是指一种新型干细胞分化技术，其利用干细胞的分化能力(differentiation)、自我再生能力(self-renewal)、自我组织化能力(self-organization)，通过三维培养再现与体内器官相似的细胞组成和结构，通过模拟与体内器官相似的环境，可以用于多种疾病的疾病模拟研究及治疗药物筛选研究的技术。据悉，最近开发的肝脏类器官可以稳定地实现长期体外培养，并显示出与实际肝脏组织相似水平的细胞组成、结构、功能性，因此可以有效应用到下一代肝病体外疾病模型研究及新药开发研究中。
5、然而，目前为止，肝脏类器官生产技术大多同时采用二维分化和三维分化，存在很难开发标准化方案、难以大量生产肝脏类器官的致命局限性。
6、为此，本专利技术优化了肝脏类器官的分化全过程，开发了通过三维分化制备肝脏类器官的方法，并基于上述方法，确定了在同一微孔板中可连续无振荡地实施整个过程的微型肝脏类器官的生产方法，从而完成了本专利技术。
7、作为上述
技术介绍
说明的事项只是用于提高对本专利技术背景的理解，不应视为本
的普通技术人员已知的现有技术。
8、在先技术文件
9、专利文献：
10、韩国授权专利公报第10-2107057号(2020.05.07公告)。
技术实现思路
1、所要解决的技术课题
2、本专利技术是为了解决这些课题而提出的，本专利技术的目的为如下：本专利技术所要解决的技术问题在于，优化肝脏类器官的分化全过程，通过三维分化开发肝脏类器官的制备方法，提供一种由通过基于所述方法在同一微孔板中连续无振荡地实施整个过程的微型肝脏类器官的生产方法生产的肝类器官，以在开发肝疾病相关新药时缩短时间和费用，且提高其成功率的一元化的全周期药物筛选方法，该药物筛选方法可在初始生产肝类器官的微孔板中一次性实现肝类器官的高速/大量生产、肝疾病的体外再现、药物功效评价的全过程。
3、技术课题的解决手段
4、为了实现以上目的，本专利技术实施例提供了利用肝脏类器官进行肝脏相关疾病的药物筛选方法，所述肝脏类器官是通过如下方法生产的肝脏类器官，所述生产方法包括：
5、(a)从人体分离的干细胞形成拟胚体(embryoid body)的步骤，
6、(b)从所述拟胚体诱导分化为肝脏组织，形成肝脏三维细胞集合体即微型肝脏的步骤，以及
7、(c)进一步分化所述肝脏三维细胞集合体的步骤；
8、所述各步骤是在同一微孔板上进行连续非振荡培养，且在所述微孔板中直接注入基质胶培养基来生产肝细胞、胆管细胞、肝星状细胞、枯否细胞以及血管细胞；
9、所述筛选方法包括：将源自肝脏相关疾病患者的细胞培养为所述肝脏类器官的步骤，使所述肝脏器官与用于诱发非酒精性脂肪性肝炎的物质接触的步骤；使候选物质与所述肝脏类器官接触的步骤，以及根据所述候选物质接触肝脏类器官的情况来评估肝脏相关疾病药物的步骤。在所述(a)步骤中，可由100个至1,000个初始起始细胞数形成拟胚体。
10、所述从人体分离的干细胞可以是全能干细胞(pluripotent stem cell，psc)或者成体干细胞(adult stem cell)。
11、所述形成肝脏三维细胞集合体的步骤可包括内胚层分化步骤或者肝母细胞分化步骤。
12、所述内胚层分化步骤可选自由定型内胚层(definitive endoderm，de)、前肠内胚层(foregut endoderm，fe)以及后前肠内胚层(posterior foregut endoderm，pfe)组成的组中的一个或多个内胚层分化。
13、在所述形成肝脏三维细胞集合体的步骤的内胚层分化步骤或者肝母细胞分化步骤中，可添加一次或多次体积比为0.1至1％的基质胶。
14、所述评估肝脏相关疾病药物的步骤包括测量各种难治性肝脏相关疾病，包括非酒精性脂肪性肝炎的生物标志物的表达，如细胞生存率、耗氧率、脂质积累、炎症反应、纤维化、肝细胞球化以及细胞外基质的过度生产和积累。
15、所述肝脏相关疾病选自肝炎病毒、单纯脂肪症、非酒精性脂肪肝、肝脏炎症、非酒精性脂肪肝炎(nash)、胆汁淤积性肝病、肝纤维化、肝硬化、肝衰竭以及肝癌中的一种或多种。
16、专利技术效果
17、根据本专利技术的利用具有与实际肝脏组织相似的结构和功能的微型肝脏类器官的生产方法进行的药物筛选方法，具有如下效果。
18、本专利技术提供基于具有与实际肝脏组织相似水平的功能性、结构、细胞组成的肝脏类器官的高速/大量生产技术，可一次进行肝脏类器官的生产、非酒精性肝炎等肝脏疾病的诱导、药物候选物质的功效评价全过程的一元化的全周期药物评价平台技术。
19、通过该方法，可在短期内大量实施消耗数月以上的时间和大量费用的基于肝脏类器官的药物功效评价研究。
20、通过该本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种利用具有与实际肝脏组织相似的结构和功能的微型肝脏类器官的药物筛选方法，其特征在于，所述肝脏类器官是通过如下的方法生产的肝脏类器官，所述生产方法包括：
2.根据权利要求1所述的肝脏相关疾病的药物筛选方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的肝脏相关疾病的药物筛选方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的肝脏相关疾病的药物筛选方法，其特征在于，
5.根据权利要求4所述的肝脏相关疾病的药物筛选方法，其特征在于，
6.根据权利要求1所述的肝脏相关疾病的药物筛选方法，其特征在于，
7.根据权利要求1所述的肝脏相关疾病的药物筛选方法，其特征在于，
8.根据权利要求1所述的肝脏相关疾病的药物筛选方法，其特征在于，
【技术特征摘要】
1.一种利用具有与实际肝脏组织相似的结构和功能的微型肝脏类器官的药物筛选方法，其特征在于，所述肝脏类器官是通过如下的方法生产的肝脏类器官，所述生产方法包括：
2.根据权利要求1所述的肝脏相关疾病的药物筛选方法，其特征在于，
3.根据权利要求1所述的肝脏相关疾病的药物筛选方法，其特征在于，
4.根据权利要求1所述的肝...
【专利技术属性】
技术研发人员：金南衡，韩东旭，金哲龙，姚学瑞，郭浩，许永男，李英花，
申请(专利权)人：广东省奥干诺伊德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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