大脑类器官及其高速和大规模制备方法技术

本发明专利技术涉及一种大脑类器官的制备方法及由其制备的三维大脑细胞集合体；所述制备方法能高速、大规模制备类器官，可进行高速的药物筛查，阻断异常分化(out

【技术实现步骤摘要】
大脑类器官及其高速和大规模制备方法


[0001]本专利技术涉及大脑(cerebrum)类器官及其高速和大规模制备方法。更具体地，涉及如何通过调节制作大脑类器官所需的初始起始细胞数量(starting cell number)和培养方式(culture format)，高速和大规模生产质量优良、个体间变异小的大脑类器官。

技术介绍

[0002]类器官是指利用干细胞的分化能力(differentiation)、自我再生能力(self
‑
renewal)、自我组织能力(self
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organization)，通过三维培养，再现与体内器官相似的细胞组成及结构，是新的干细胞分化技术，通过模拟与体内器官相似的环境，可用于多种疾病的疾病模拟研究以及治疗药物筛查的研究。该技术通过生产患者量身定做型类器官，进而可以低成本、短期内生产出针对多种疾病患者的量身定做型治疗剂。
[0003]最近有报道称可以生产出反映不同脑部特征的脑类器官。同时，利用脑类器官进行寨卡病毒(ZIKA virus)研究或利用患者来源的脑类器官进行疾病模拟及新药开发的研究也在积极进行中。
[0004]然而，为患者量身定做的脑类器官生产成本高、耗时长。如图1所示，生产真正患者来源的诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSCs)通常需要6到8周以上，其有效率也很低，通常只有0.02％左右。进而，生产类器官所需的时间根据各类器官的不同而不同，但对于脑类器官，大部分需要3至6个月以上。因此，对于年龄较大的患有退行性脑病的患者及其他急需药物治疗的患者来说，为患者量身定做的新药研发在现实中存在一定难度。
[0005]此外，包括脑类器官在内的大多数类器官的生产都存在以下问题，这些都是类器官研究实用化或产业化必须解决的问题。
[0006]第一，大部分类器官的生产不是以商用化技术为基础的大规模生产，而是通过研究室水平的小大规模生产体系进行生产，为了类器官技术的商用化，必须开发大规模生产技术。
[0007]第二，一般来说，类器官的生产效率和重现性比较低，因此类器官技术的商用化要求开发标准化的高速方案。
[0008]第三，类器官生产成本高，耗时长。类器官分化技术大多是通过体外再现体内器官发育过程而发展起来的。在体外由于模拟了长达数月的体内器官发育过程，多级分化过程通常是生产类器官所必需的。进而，为了实现类器官功能结构的成熟，大部分需要利用震荡生物反应器(shaking bioreactor)，在CO2孵化器(incubator)内进行持续的震荡(shaking)过程，同时还需要长期的分化和成熟过程。以脑类器官为例，通常要求有数月以上(3～6个月)的分化及成熟过程，且各分化阶段需使用高价促分化因子长期处理，因此生产类器官的成本高昂(图1)。
[0009]第四，类器官间个体间变异和批次间变异(batch variation)非常严重(图2)，因此，在利用类器官进行的疾病模拟研究和大剂量新药筛查研究中，可能会导致不准确的结
果。
[0010]第五，脑部类器官分化时会产生“异常分化(out
‑
growth)”的异常非外胚层组织，这是影响脑部类器官品质和功能性等的严重问题(图2)。
[0011]第六，基于类器官的高速大量筛查(high
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throughput screening，HTS)；为了通过HTS进行药物筛查(drug screening)或药物再造(drug repositioning)研究，需要开发符合96孔板、384孔板等商用化HTS格式(format)的类器官大规模生产系统。此外，在HTS格式下生产类器官，将疾病的体外再现和药物筛查的整个过程一元化，可进行全周期one
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step类器官生产及新药开发系统的开发，是今后构建基于类器官技术的新药开发平台及开发多种疑难疾病的治疗剂所必须的部分。

技术实现思路

[0012]要解决的问题：
[0013]为了高速/大规模生产大脑类器官，本专利技术不使用类器官生产中通常使用的震荡生物反应器(shaking bioreactor)，不使用个别研究者设计的concave Multiwell等非商用化平台，而是实现了商用化，易于购买，进而进行了成像分析。使用适合于利用96或384孔(well)微孔板等进行药物筛查分析研究等商用化的高速大量筛查(high throughput screening，HTS)平台(platform)，生产大脑类器官。它不仅可以像图3一样在HTS平台上生产大脑类器官，能够以100％的效率实现标准化水平的个体间变异最小化、非正常分化受到抑制的大脑类器官的高速、大规模生产，高速、大规模生产的大脑类器官的均质性和功能性明显高于现有方法生产的大脑类器官的均质性和功能性。进而确认可以降低生产大脑类器官所需的时间和费用。
[0014]但是，本专利技术所要解决的问题不限于以上所述的问题，未述及的其他问题可以从下列记载中为具有该
通常知识的人明确理解。
[0015]解决问题的手段：
[0016]本专利技术的第一方面，提供了一种三维大脑细胞集合体的制备方法，包括以下步骤：a)在同一微孔板上准备至少100个至9000个人类干细胞；b)从所述人类干细胞形成胚状体；c)从所述胚状体诱导神经外胚层分化；d)从所述神经外胚层诱导神经分化，即形成神经外胚层上皮(Neuroepithelium)；和e)诱导所述神经外胚层上皮成熟，形成三维大脑细胞集合体。
[0017]根据本专利技术实施例，所述人类干细胞可以包括以下任何一种或多种：人类胚胎干细胞、人类全分化能干细胞、成体干细胞；所述人类全分化能干细胞包括诱导多能干细胞；所述成体干细胞包括人类神经干细胞。
[0018]根据本专利技术实施例，所述a)至e)步骤可以是在同一微孔板上连续非震荡培养。
[0019]根据本专利技术实施例，所述微孔板可以包括基质胶(matrigel)。基质胶的浓度可以是0.1到5％(v/v)，更具体的是基质胶可以直接添加到培养基中。添加基质胶的步骤，优选是所述c)至e)步骤中的至少一个步骤，更优选是在所述d)步骤的神经分化阶段。
[0020]根据本专利技术实施例，所述b)步骤是一个或多个胚状体在培养基中进行，所述培养基包括：DMEMF12、KSR(血清替代物)、胎牛血清(FBS，Fetal Bovine Serum)、谷氨酰胺(Glutamax)、青霉素/链霉素(Penicillin/Streptomycin，P/S)、β
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巯基乙醇(β
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mercaptoethanol)、肝素(heparin)、Y27632(ROCK抑制剂)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。
[0021]根据本专利技术实施例，所述c)步骤是包含一个或多个细胞的胚状体在培养基中进行，所述培养基包括：DMEMF12、Neurobasal培养基(神经细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种三维大脑细胞集合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：a)在同一微孔板上准备至少100至9000个人类干细胞；b)从所述人类干细胞形成胚状体；c)从所述胚状体诱导神经外胚层分化；d)从所述神经外胚层诱导形成神经外胚层上皮；和e)诱导所述神经外胚层上皮成熟，形成三维大脑细胞集合体。2.根据权利要求1所述的方法，所述人类干细胞包括人类胚胎干细胞、人类全分化能干细胞、成体干细胞；所述人类全分化能干细胞包括诱导多能干细胞；所述成体干细胞包括人类神经干细胞。3.根据权利要求1所述的方法，所述a)至e)步骤是在同一微孔板上连续非震荡培养。4.根据权利要求1所述的方法，所述a)至d)步骤是在同一微孔板上连续非震荡培养。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，在所述c)至e)步骤中至少任一步骤中，0.5至5％的基质胶被直接添加到培养基中。6.根据权利要求1所述的方法，所述b)步骤是一个或多个胚状体在培养基中进行，所述培养基包含：DMEMF12、KSR、胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素/链霉素、β
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巯基乙醇、肝素、Y27632和bFGF。7.根据权利要求1所述的方法，所述c)步骤是包含一个或多个细胞的胚状体在培养基中进行，所述培养基包含：DMEMF12、Neurobasal培养基、N2 100X、无维生素A的B27、谷氨酰胺、青霉素/链霉素、非必需氨基酸、β
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巯基乙醇、肝素、二氢脱氧吗啡、A83
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01、SAG和IWP2。8.根据权利要求1所述的方法，所述d)步骤是一个或多个神经外胚层在培养基中进行，所述培养基包含：DMEMF12、Neurobasal培养基、N2 100X、无维生素A的B27、谷氨酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：金南衡，韩东旭，郭浩，姚雪瑞，金哲龙，
申请(专利权)人：广东省奥干诺伊德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：