本发明专利技术提供一种促使间充质干细胞(MSC)分化为少突胶质前体细胞的方法，包括将分离的MSC原代培养、二次传代培养后，以含有“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体进行处理，再采用“少突胶质前体细胞分化培养基”进行分化培养。本发明专利技术通过特定细胞分化处理和培养工艺，使用经过重组人层粘连蛋白处理的细胞培养基质，对MSC进行培养、促使其分化，在较短时间内获得MSC来源少突胶质前体细胞。本发明专利技术进一步提供了一种高效收获少突胶质前体细胞的方法，具体通过一种限速摇动方法，收获少突胶质前体细胞并允许进一步增殖，可以在短时间内收获较大量且纯度较高的少突胶质前体细胞，用于生产细胞治疗产品。用于生产细胞治疗产品。用于生产细胞治疗产品。
【技术实现步骤摘要】
一种促使MSC分化为少突胶质前体细胞的方法
[0001]本专利技术涉及细胞生物学
，特别涉及一种促使间充质干细胞(MSC)分化为少突胶质前体细胞的方法。
技术介绍
[0002]中枢神经系统损伤或发育不良会引起神经细胞凋亡、神经组织缺损、运动及思维等能力缺陷，最终导致终身残疾甚至寿命缩短。中枢神经系统自我修复能力极低，治疗此类疾病需要使用细胞替代疗法，对凋亡缺损的神经细胞和组织进行补充，进而恢复神经系统的功能。
[0003]少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor，OPs)在中枢神经系统发育过程中负责髓鞘的产生，对中枢神经系统的正常发育和运作起关键作用，因各种原因导致的OP或髓鞘损伤是中枢神经系统发育或功能异常的重要原因，会直接导致脑白质营养不良、小儿脑瘫等严重疾病，同时和脊髓损伤、脑卒中等伤病的恶化有关，对人类健康有重大威胁。既往的研究表明，移植OP可以修复髓鞘，从根本治疗脑白质营养不良、小儿脑瘫等疾病，也可以显著促进脊髓损伤、脑卒中等伤病的康复，但OP来源极为有限，限制了其临床应用。成体OP的分离依赖于组织学部位，一般成年人体内几乎无法取材，而流产胎儿脑组织分离OP受到伦理学限制，每批次脑组织样本分离得到的OP在质量上不均一，影响治疗效果。近些年来，对干细胞分化机制的研究取得了很大进展，发现胚胎干细胞及诱导多能干细胞均有少突胶质前体细胞分化潜能，但胚胎干细胞的适用同样受到伦理学限制，并且胚胎干细胞及诱导多能干细胞分化少突胶质前体细胞的工艺耗时长、成本高、失败几率大、批次间质量波动大，不利成药及临床应用。
[0004]间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)可从脂肪、脐带、骨髓等多种组织采集，是样本资源最丰富的成体干细胞，是基于干细胞再生医学的最有前景的种子细胞。目前应用于间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法极为有限，仅限于使用多种生长因子诱导MSC先分化为神经干细胞，再分化为少突胶质前体细胞。细胞生长因子诱导法存在诱导效率低下，诱导周期长，且批次间质量波动较大和产量低等缺点。因此，本领域还有必要开发改进的技术，来提高分化效率、提高少突胶质前体细胞的质量和产量。
技术实现思路
[0005]针对现有技术中的缺陷，本专利技术提出了一种促使MSC分化为少突胶质前体细胞的方法。具体为一种通过表观遗传学手段，对MSC进行培养的方法，所述方法可以促使MSC以较高效率分化成少突胶质前体细胞，在缩短分化耗时同时，提高少突胶质前体细胞的质量和产量。
[0006]本专利技术首先提供一种促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞产量的方法，包括如下步骤：
[0007](1)分离间充质干细胞，原代培养；
[0008](2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；
[0009](3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；
[0010](4)对第二次传代培养后的间充质干细胞，以含有“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体进行处理，其后再次传代接种于细胞培养基质表面，添加“少突胶质前体细胞分化培养基”进行分化培养，完成少突胶质前体细胞分化，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”以及“重组人层粘连蛋白”处理，所述“少突胶质前体细胞分化培养基”为无动物源性配方。
[0011]进一步的，步骤(1)中所述的间充质干细胞来源于人类。来源于人类的间充质干细胞用于获得人少突胶质前体细胞，可应用于人髓鞘损伤性疾病的治疗。
[0012]进一步的，所述间充质干细胞来源包括骨髓、脐血、脐带、胎盘和脂肪组织。所述组织都是人体容易获取间充质干细胞的组织。
[0013]进一步的，步骤(1)中所述的原代培养采用的培养基、步骤(2)和(3)中所述的细胞培养基均为MSC基础培养基，成分为MEM
‑
alpha+5％人血小板提取物。
[0014]进一步的，步骤(2)和(3)中的所述细胞培养基质为细胞培养皿、细胞培养板或细胞工厂；步骤(4)中的所述细胞培养基质为细胞培养皿或细胞培养瓶。
[0015]进一步的，步骤(4)中所述的间充质干细胞起始密度为0.1
×
104/cm2～1.0
×
104/cm2。
[0016]进一步的，步骤(4)所述的间充质干细胞起始密度为1.0
×
104/cm2。此起始密度获得的少突胶质前体细胞产量更高。
[0017]进一步的，步骤(4)所述的含有“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体可以是慢病毒一类的病毒载体、质粒载体、游离形载体或mRNA载体。
[0018]进一步的，步骤(4)所述的“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体含有的基因包括Olig2和Sox10。
[0019]进一步的，步骤(4)所述的以含有“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体进行处理的具体步骤为：将第二次传代培养后的间充质干细胞以细胞悬液状态进行质粒载体转染，每5
×
106个细胞电转5～10μg Olig2和5～10μg Sox10质粒。更优选每5
×
106个细胞电转10μg Olig2和10μg Sox10质粒，该条件下获得的少突胶质前体细胞纯度和产量更高。
[0020]进一步的，步骤(4)中所述的分化培养的时间为15～25天。
[0021]进一步的，步骤(4)中所述的分化培养的时间为20天。
[0022]本专利技术还提供一种将前述方法得到的少突胶质前体细胞进行增殖的方法，包括如下步骤：
[0023]S1、在完成少突胶质前体细胞分化后，将细胞培养基质置于摇动装置，确保密封后，在37℃以每分钟120～240次，幅度为1.5～4.5厘米条件下进行15～20小时的水平摇动，促使少突胶质前体细胞从细胞培养基质表面分离，而其余细胞保持贴壁；
[0024]S2、完成摇动后，收集含有少突胶质前体细胞的培养基，并将其注入新的细胞培养基质表面(少突胶质前体细胞传代)，添加“少突胶质前体细胞增殖培养基”进行增殖培养，
完成少突胶质前体细胞增殖，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”以及“重组人层粘连蛋白”处理。
[0025]进一步的，所述步骤S1的摇动条件为每分钟120～240次，幅度为1.5～3.0厘米，时间为15～20小时。
[0026]进一步的，所述步骤S1的摇动条件为每分钟180次，幅度为3.0厘米，时间为20小时。此参数下少突胶质前体细胞分离数量和纯度皆较高。
[0027]进一步的，步骤S1中的所述细胞培养基质为可密封的细胞培养瓶；步骤S2中所述的细胞培养基质为细胞培养皿、细胞培养板或细胞工厂。
[0028]进一步的，步骤S2中所述增殖培养的少突本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)分离间充质干细胞，原代培养；(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”处理；(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养基质表面，添加细胞培养基，进行第二次传代培养，所述细胞培养基质未经过“促进细胞贴壁”处理；(4)对第二次传代培养后的间充质干细胞，以含有“少突胶质前体细胞分化关键基因”的基因表达载体进行处理，其后再次传代接种于细胞培养基质表面，添加“少突胶质前体细胞分化培养基”进行分化培养，完成少突胶质前体细胞分化，所述细胞培养基质经过“促进细胞贴壁”以及“重组人层粘连蛋白”处理。2.根据权利要求1所述的促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述步骤(1)中所述的间充质干细胞来源于人类。3.根据权利要求2所述的促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，所述间充质干细胞来源包括骨髓、脐血、脐带、胎盘和脂肪组织。4.根据权利要求1所述的促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，步骤(2)和(3)中的所述细胞培养基质为细胞培养皿、细胞培养板或细胞工厂；步骤(4)中的所述细胞培养基质为细胞培养皿或细胞培养瓶。5.根据权利要求1所述的促使间充质干细胞分化为少突胶质前体细胞的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的间充质干细胞起始密度为0.1
×
104/cm2～1.0
×
104/cm2。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的间充质干细胞起始密度为1.0
×
104/cm2。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的分化培养的时间为15～25天。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述的分化培养的时间为20天。9.一种将权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐轶冰，林楷，
申请(专利权)人：林楷，
类型：发明
国别省市：
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