【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因编辑，尤其涉及到一种基于crispr-cas9的lager酵母的从头构建方法。
技术介绍
1、采用低温底层发酵的拉格(lager)啤酒15世纪开始在德国巴伐利亚地区出现，19世纪初流行至全世界，目前已成为全球产量最高的酒精饮料。目前已阐明，拉格啤酒发酵酵母为巴斯德酿酒酵母(saccharomyces pastorianus)，该种是一个杂交种，由艾尔(ale)啤酒酵母(saccharomyces cerevisiae)与野生真贝氏酿酒酵母(saccharomyces eubayanus)杂交而成，后者赋予了拉格啤酒酵母的耐低温能力。
2、杂交育种是将父母本杂交，形成不同的遗传多样性，再通过对杂交后代的筛选，获得具有父母本优良性状的育种方法。酵母的杂交育种可以将双亲控制不同性状的优良性状结合于一体，还可以产生杂种优势，获得比亲本品种更强或表现更好的新品种。其原理是通过增加遗传多样性即不同基因组合的数量，从而产生新的优良性状。
3、酵母的单倍体细胞有a型和α型之分。接合型分别由mata和matα2个基因控制。相同接合型酵母细胞不能发生接合。酵母细胞可定期的相互转换它们的接合型，前期研究证明所有酵母细胞中同时含有mata和matα2个基因，但只有一类基因获得表达。接合型基因mat位于3号染色体上，两侧有两个沉默基因hmla和hmrα。参与接合型转换的基因还有ho(homothalism)。这种基因转换是由ho内切酶引发的。
4、大多数工业啤酒酵母菌株均为mata/matα，由于工业
技术实现思路
1、本专利技术提供了一种基于crispr-cas9的lager酵母的从头构建方法，其通过基因编辑分别对酿酒酵母及非酿酒酵母的真贝氏酵母的mat基因进行改造，完成不同酵母菌株的结合型转换，进一步通过酿酒酵母及真贝氏酵母的种间杂交，实现了lager酵母的从头构建，为新风味菌株的获得及新风味产品的开发开创无限可能。
2、为了达到上述目的，本专利技术提供了一种基于crispr-cas9的lager酵母从头构建，通过基因编辑对酿酒酵母s.cerevisiae及非酿酒酵母的真贝氏酵母s.eubayanus的mat基因进行改造，完成酵母菌株的接合型转换，通过酵母杂交实现lager酵母的从头构建。
3、作为优选，所述mat基因包括mata和matα基因。
4、作为优选，通过基因编辑分别对酿酒酵母及真贝氏酵母mat基因进行改造具体为：
5、分别构建针对mata的pudp004和matα的prcc-k重组质粒，即mata-pudp004和matα-prcc-k，通过将其直接转化至不同的酿酒酵母感受态细胞中，基于抗性平板及选择性培养基的筛选，快速实现酵母菌株的杂交。可以理解的是，prcc-k、pudp004质粒为已知质粒，其序列均可从https://www.addgene.org/中查询获得。
6、作为优选，mata-pudp004和matα-prcc-k质粒的核苷酸序列分别如seq id no：1、seq id no：2所示；
7、通过将mata-pudp004质粒和matα-prcc-k质粒分别转化至不同的酵母亲本，实现不同酵母的杂交。
8、作为优选，构建针对pudp004的mata重组质粒具体为：
9、设计并合成mat基因特异的如seq id no：5所示的crrna-tracerrna chimera序列；
10、将所合成序列连入puc57载体，并将含有puc57-mata-sgrna质粒的e.coli保种，通过质粒提取试剂盒提取质粒puc57-mata-sgrna；
11、设计用于mata-crrna-tracerrna chimera扩增的引物序列，对提取的质粒进行目的片段pcr扩增序列，扩增后对所得mata-crrna-tracerrna chimera pcr产物进行切胶回收；
12、提取质粒pudp004，并将质粒pudp004及mata-crrna-tracerrna chimera pcr产物进行bsai酶切，t4连接后，将连接产物转至dh5α感受态细胞中，得到重组质粒pudp004-mata的阳性克隆，对其进行验证后，得到重组质粒mata-pudp004。
13、可以理解的是，上述方法具体包括以下步骤：
14、1)设计并合成mata基因特异的crrna-tracerrna chimera序列：
15、设计合成序列mata-crrna-tracerrna chimera，其核苷酸序列如seq id no：5所示。
16、2)将上述合成片段连入puc57载体：
17、将含有puc57-mata-sgrna质粒的e.coli保种，并通过质粒提取试剂盒进行质粒提取。
18、3)设计引物，对提取的质粒(puc57a-mata-sgrna)进行目的片段pcr扩增序列：
19、为获得完整的mata-crrna-tracerrna chimera，合成用于mata-crrna-tracerrnachimera扩增的引物，并在上下游引物的5’端加上保护碱基tt。
20、用于mata-crrna-tracerrnachimera扩增的引物序列包括pudp004-mata-fw和pudp004-mata-rv，其核苷酸序列分别如seq id no：6、seq id no：7所示。
21、pcr反应扩增体系如下：5x phusion buffer 10μl，2mm dntps 5μl，pudp004-mata-fw 1μl，pudp004-mata-rv 1μl，plasmid 1μl，phusion polymerase 0.5μl，h2o 31.5μl，共计50μl；
22、pcr反应扩增条件如下：98℃30s；98℃10s，65℃30s，72℃15s，30个循环；72℃10min，4℃保存。
23、4)mata-crrna-tracerrnachimera pcr产物切胶回收，检测浓度：
24、用genejet gel extraction kit试剂盒进行pcr产物的切胶回收。
25、5)提取质粒pudp004
26、将含有pudp004的e.coli接菌至含有氨苄(amp)抗性的lb培养基中，37℃培养16h本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas9的Lager酵母的从头构建方法，其特征在于，通过基因编辑对酿酒酵母S.cerevisiae及非酿酒酵母的真贝氏酵母S.eubayanus的MAT基因进行改造，完成酵母菌株的接合型转换，通过酵母杂交实现Lager酵母的从头构建。
2.根据权利要求1所述的从头构建方法，其特征在于，所述MAT基因包括MATa和MATα基因。
3.根据权利要求2所述的从头构建方法，其特征在于，通过基因编辑对酿酒酵母S.cerevisiae及非酿酒酵母的真贝氏酵母S.eubayanus的MAT基因进行改造具体为：
4.根据权利要求3所述的从头构建方法，其特征在于，MATa-pUDP004和MATα-pRCC-K质粒的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示；
5.根据权利要求3或4所述的从头构建方法，其特征在于，构建针对pUDP004的MATa重组质粒具体为：
6.根据权利要求5所述的从头构建方法，其特征在于，用于MATa-crRNA-tracerRNAchimera扩增的引物序列包括p
7.根据权利要求6所述的从头构建方法，其特征在于，PCR反应扩增体系如下：5XPhusion Buffer 10μl，2mM dNTPs 5μl，pUDP004-MATa-FW 1μl，pUDP004-MATa-RV 1μl，Plasmid 1μl，Phusion polymerase 0.5μl，H2O31.5μl，共计50μl；
8.根据权利要求3或4所述的从头构建方法，其特征在于，构建针对pRCC-K的MATα重组质粒具体为：
9.根据权利要求8所述的从头构建方法，其特征在于，所述基因编辑sgRNA引物序列包括MATα-sgRNA-FW、MATα-sgRNA-RV，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示。
10.根据权利要求8所述的从头构建方法，其特征在于，PCR反应扩增体系如下：5XPhusion Buffer 10μl，2mM dNTPs 5μl，MATα-sgRNA-FW 1μl，MATα-sgRNA-RV 1μl，Plasmid2μl，Phusion polymerase 0.5μl，H2O 30.5μl，共计50μl；
...【技术特征摘要】
1.一种基于crispr-cas9的lager酵母的从头构建方法，其特征在于，通过基因编辑对酿酒酵母s.cerevisiae及非酿酒酵母的真贝氏酵母s.eubayanus的mat基因进行改造，完成酵母菌株的接合型转换，通过酵母杂交实现lager酵母的从头构建。
2.根据权利要求1所述的从头构建方法，其特征在于，所述mat基因包括mata和matα基因。
3.根据权利要求2所述的从头构建方法，其特征在于，通过基因编辑对酿酒酵母s.cerevisiae及非酿酒酵母的真贝氏酵母s.eubayanus的mat基因进行改造具体为：
4.根据权利要求3所述的从头构建方法，其特征在于，mata-pudp004和matα-prcc-k质粒的核苷酸序列分别如seq id no：1、seq id no：2所示；
5.根据权利要求3或4所述的从头构建方法，其特征在于，构建针对pudp004的mata重组质粒具体为：
6.根据权利要求5所述的从头构建方法，其特征在于，用于mata-crrna-tracerrnachimera扩增的引物序列包括pudp004-mata-fw和pudp004-mata-rv，其核苷酸序列分别如se...
【专利技术属性】
技术研发人员：贺扬，余俊红，胡淑敏，赵玉祥，万秀娟，侯晓平，陈嵘，杜腾飞，
申请(专利权)人：青岛啤酒股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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