【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和植物保护领域，具体涉及一种鉴定b型烟粉虱新烟碱类杀虫剂靶点基因突变的pcr引物对及其应用。
技术介绍
1、烟粉虱bemisiatabaci，是一种世界性农业害虫。其寄主适应性强，可取食寄主植物多达74科500多种，且广泛分布于全球90余个国家地区，对农业生产造成了巨大的经济损失。除了取食植物，影响其生长外，烟粉虱还是许多植物病毒的传播媒介。由其传播病毒引起的危害甚至会造成农作物的绝收。在中国，烟粉虱在90年代末期成为重大的农作物害虫。由于其入侵性强，烟粉虱目前已经扩散至全国各地，对我国各地的农业生产都造成了巨大的威胁。鉴于其广泛的作物危害种类，及对作物严重的危害性，烟粉虱的防治工作刻不容缓。
2、目前对烟粉虱的防控主要依赖化学防治，尤其是新烟碱类杀虫剂，自其进入中国杀虫剂市场后，一直是防治烟粉虱的首选药剂。田间常用的包括吡虫啉、噻虫嗪、噻虫啉、噻虫胺、啶虫脒、烯啶虫胺、呋虫胺，这七种新烟碱杀虫剂。由于长期大量投入使用，烟粉虱已对新烟碱类杀虫剂产生了较强的抗性。近年来，我国多数省份都陆续有烟粉虱对新烟碱类杀虫剂产生抗性的报道，北至黑龙江、南至海南、西至青海、东到上海的大部分地区均有烟粉虱分布和危害，且抗药性普遍很高。因此抗药性是导致烟粉虱大爆发且难以治理的主要原因之一。
3、害虫抗药性机制的阐明有助于害虫的抗药性治理，但目前人们对烟粉虱新烟碱类杀虫剂的抗性机制的了解依然较为缺乏。有关新烟碱类杀虫剂的抗性机制的理解，目前主要有代谢解毒抗性和靶标突变抗性两种。代谢解毒抗性，是由抗性害虫体
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种烟粉虱的新烟碱类杀虫剂作用靶标基因nachr基因btβ1是否突变的pcr引物对，以及一种鉴定烟粉虱的新烟碱类杀虫剂作用靶点基因nachr基因btβ1是否突变的方法。烟粉虱对于新烟碱类杀虫剂的靶标抗性检测尚无特异性的突变位点，本专利技术提供了一个烟粉虱对于新烟碱类杀虫剂的靶标抗性检测的突变位点，并通过烟粉虱杀虫靶标基因btβ1的第三外显子中的碱基位点突变来检测田间烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗性水平，弥补了该领域的空白，为田间烟粉虱对新烟碱类杀虫剂抗药性快速检测及抗性演化风险评估提供了理论基础。
2、因此，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种鉴定烟粉虱新烟碱类杀虫剂靶点基因nachr基因btβ1是否突变的pcr引物对，所述引物对核苷酸序列如下：
4、btβ1突变鉴定-f：attctatcctggcgtaactcgc
5、btβ1突变鉴定-r：tgatgtacttatggctgctgctacta。
6、本专利技术还提供一种鉴定烟粉虱新烟碱类杀虫剂靶点基因nachr基因btβ1是否突变的方法，该方法包括如下步骤：
7、(1)烟粉虱btβ1突变检测样品准备；
8、(2)利用所述btβ1突变鉴定引物进行pcr及pcr产物测序鉴定；
9、(3)分析序列中163，164位c，g或者g，a的比率，从而评估其对新烟碱类杀虫剂的抗性水平。
10、所述的引物对或所述的方法，其中所述烟粉虱为b型烟粉虱。
11、所述反应体系如下：
12、
13、所述反应程序如下：
14、
15、所述的pcr引物对或所述的方法在检测烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗性水平中的应用。
16、优选地，包括如下步骤：
17、(1)烟粉虱检测样品准备；
18、(2)利用所述btβ1突变鉴定引物进行pcr及pcr产物测序鉴定；
19、(3)分析序列中163，164位c，g或者g，a的比率，从而评估其对新烟碱类杀虫剂的抗性水平及抗性演化风险。
20、具体地，所述的烟粉虱为b型烟粉虱。
21、更具体地，序列中163，164位c，g或者g，a的比率多少可以用于评估对新烟碱类杀虫剂产生的抗性水平。本专利技术中抗性水平高低与突变频率之间存在正相关性。，由于烟粉虱个体比较小，通常是将多个烟粉虱一起提取dna进行检测，因此是针对一种群来进行检测。而一个种群中可能些已经有突变，有些还没有突变。但是目前无法量化的界定多少突变频率以下，不会对新烟碱类杀虫剂产生抗性或者只产生低抗性。理论上只要存在该突变体，无论频率高低，都有演化为高突变抗性种的风险。因此一般地，纯合突变种群会对新烟碱类杀虫剂表现出最高的抗性。种群突变频率越高，会对新烟碱类杀虫剂表现出更强的抗性(实验数据显示85％频率以上会产生极高抗性)。但更值得注意的是，即使是田间存在的杂合突变种群，也有相当大的概率在药剂选择压力下向纯合衍化。因而，本专利技术更重要的作用在于，对田间有无该突变体的检测。检测到田间存在的突变体后，推荐合理用药，配合其他非nachr杀虫靶标类型农药共同防治，以防止新烟碱类杀虫剂抗药性的进一步演化，对农业生产防治过程中产生不必要的经济损失。本专利技术还提供烟粉虱新烟碱类杀虫剂靶点基因nachr基因btβ1的突变位点，所述突变位点位于第三外显子，通过突变引物测序后所得序列，检测163，164位c，g或者g，a的比率，通过统计该两个位点ga的频率来评估对新烟碱类杀虫剂的抗性水平，该两个位点在新烟碱类杀虫剂抗性中主要为ga碱基，而在敏感种群中主要以cg碱基形式出现。由此可以得出抗性水平和是否存在抗性演化风险的结论。
22、本专利技术具有以下有益效果：本专利技术通过烟粉虱新烟碱类杀虫剂靶点基因nachr基因btβ1的第三外显子区域中的碱基位点突变来检测田间烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗性水平和是否存在抗性演化风险，弥补了该领域的空白，为田间烟粉虱对新烟碱类杀虫剂抗药性快速检测提供了理论基础。通过本专利技术的应用，科研快速检测田间烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的抗药性水平，从而为合理使用杀虫剂提供了技术支撑。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种鉴定B型烟粉虱新烟碱类杀虫剂靶点基因nAChR基因BTβ1是否突变的PCR引物对，所述的突变是靶点基因nAChR基因BTβ1序列中第三外显子区域162，163位点是否存在突变，优选地，所述引物对核苷酸序列如下：
2.一种鉴定B型烟粉虱新烟碱类杀虫剂靶点基因nAChR基因BTβ1是否突变的方法，其特征在于包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述162和163位点在新烟碱类杀虫剂抗性中为GA碱基，而在敏感种群中以CG碱基形式出现，通过检测该位点的碱基形式来判断烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的大概率的抗药性水平。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：判断烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的大概率的抗药性水平的方法是检测162，163位CG或者GA的比率，通过统计该位点GA的频率来检测对新烟碱类杀虫剂的抗性水平。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述反应体系如下：
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述反应程序如下：
7.如权利要求1所述的PCR引物对或如权利要求2至
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的烟粉虱为B型烟粉虱。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，序列中163，164位C，G或者G，A的比率来表明对新烟碱类杀虫剂的抗性水平或其潜在的抗性演化风险。
...【技术特征摘要】
1.一种鉴定b型烟粉虱新烟碱类杀虫剂靶点基因nachr基因btβ1是否突变的pcr引物对，所述的突变是靶点基因nachr基因btβ1序列中第三外显子区域162，163位点是否存在突变，优选地，所述引物对核苷酸序列如下：
2.一种鉴定b型烟粉虱新烟碱类杀虫剂靶点基因nachr基因btβ1是否突变的方法，其特征在于包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述162和163位点在新烟碱类杀虫剂抗性中为ga碱基，而在敏感种群中以cg碱基形式出现，通过检测该位点的碱基形式来判断烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的大概率的抗药性水平。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：判断烟粉虱对新烟碱类杀虫剂的大概率的抗药性水平的方法是检测16...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨鑫，张友军，殷城，刘少楠，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：
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